A novel label-free fluorescence assay for dipeptidyl peptidase 4 activity detection based on supramolecular self-assembly

Abstract

A novel supramolecular system CB[7]-GPFG for dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) activity detection in biological samples and inhibitor screening.

Enzyme assays with supramolecular chemosensors – the label-free approach

“…26c ). 102 DPP4 cleaves off dipeptides from the N-terminus of peptides or small proteins (below 80–100 residues) with a preference for proline or alanine in the S1 position of the cleaved peptide bond. 103 The tetrapeptide H–Gly–Pro–Phe–Gly–OH is an established substrate, which yields H–Phe–Gly–OH after enzymatic cleavage.…”

“…DPP4 activity is thus of interest in clinical diagnosis and the supramolecular tandem DPP4 assay (Section 5.1) was compared to a commercial ELISA kit for DPP4 quantification. 102 DPP4 concentrations were quantified in clinical blood plasma samples based on the linear dependence of the hydrolysis rate of the Gly–Pro–Phe–Gly substrate by DPP4 in the tandem enzyme assay. The detected DPP4 concentration correlated well with the results from the ELISA kit and a higher DPP4 activity in blood plasma samples from type II diabetes patients was clearly confirmed.…”

“…109 Actual screening applications are commonly performed in 96 and 384-well microtiter plates and require robust assay procedures. 60,65,90,102,108,110 The ODC assay was found to be tolerant to the required buffer additives dithiothreitol (DTT), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pyridoxal-5 0 -phosphate (PLP), Tween 80, and 1% DMSO and could be miniaturized to the microplate format to demonstrate its potential in HTS applications. The performance of the assay was excellent and gave a Z 0 factor 0.96 in 96-well microplates and of 0.90 in 384 well-microplates.…”

“…77 Moreover, the DPP4 assay by Wang and Bi (see Section 5.1) was validated with saxagliptin as a known inhibitor and then used to screen a library of >300 compounds from traditional Chinese medicine for potential inhibitory effects on DPP4. 102 This identied the polyphenols salvianolic acid C, herbacetin, and ellagic acid as previously unknown DPP4 inhibitors with micromolar IC 50 values.…”

Identification of active substances from Traditional Chinese Medicine: state-of-the-art and perspectives

“…在线筛选。Hou [24] 等人利用血管平滑肌细胞膜色谱-气相色谱/质谱联用技术，从白芷、黄芪、 参、蛇子中发现了可舒张 KCL 刺激的胸动脉预收缩的活性化合物。Wang [25] 等人通过人表 皮鳞状细胞膜色谱结合高效液相色谱和质谱联用方法，从苦参中发现表皮生长因子受体拮 抗剂。Wu [26] 等人报道了 CMC 与超高效液相色谱飞行时间质谱联用筛选远志中的自噬诱导 物。Wang [25] 等人将人表皮鳞状细胞(A431 细胞)的细胞膜吸附到基质表面制成固定相用 于中药提取物样品分离，由于该细胞高表达表皮生长因子受体(EGFR) ，故样品中含有的 活性物质会与 EGFR 相互作用，保留时间延长。作者用该生物色谱筛选苦参提取物中 EGFR 抑制剂。Yusi Bu [27] 高、分析速度快、样品消耗少等独特优势 [28,29] 。酶可以固定在 CE 的内表面上或使用生物 反应器作为 CE 的入口。由于生化分析被集成到 CE 的分离过程中，避免了底物和复杂样品 基质的干扰。Li [30] 等人利用 CE 结合高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)筛选天然产物 提取物中表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，对 39 种中药天然产物提取物进行了研究。 1.3.3 生物反应器/生物芯片 生物反应器已成为分析和筛选生物活性化合物的一种有吸引力的介质，其中酶固定化 微反应器极具潜力。适用于固定化酶的表面类型包括玻璃、琼脂糖、磁珠以及其他聚合材 料 [31] 。固定化酶反应器(IMERs)也成为一种有效的亲和筛选潜在酶抑制剂或活化剂的技 术，也经常与 CE 结合使用。Mohamed [32] 等人使用多层 CE-IMERs 在线检测绿茶提取物对 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的活性和抑制作用。Zhang [33] 等人介绍了一种利用 IMER 从 天然产物中筛选 α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其中金纳米粒子共价吸附在毛细管表面作为 固定相。Schejbal [34] 等人使用磁性微粒为药物代谢酶 CYP2C9 创造了一种 IMER，将酶反应 混合孵育、分离、检测和定量集成为一个单一的全自动过程，实现了 CYP2C9 的在线研究。 生物芯片是一种表面以阵列形式接上细胞、多肽、抗原、抗体、激酶以及各种功能性 生物分子的载体(如玻璃片、金属片、云母片、滤膜、纳米微球和微孔板)等，从而形成 具有特殊筛选靶点的反应平台，用于筛选复杂样品中的能与这些生物靶点特异性结合的活 性物，快速、简便以及高通量，多用于疾病的诊断、生物标志物的发现、药物活性物质筛 选以及药物作用靶点的鉴定等。Zhang [35] [37] 设计了一种能够特异性检测 Sirt1 蛋白的荧光探针，并在体外筛 选得到了 19 个天然产物来源的 Sirt1 激动剂，并在叔丁基过氧化氢诱导的 H9c2 心肌细胞氧 化损伤的模型上对筛选得到的化合物进行验证；也针对二肽基肽酶-4(DPP4)开发了一种 新型荧光探针，用于监测临床样品中的 DPP4 活性，并在中药 DPP4 抑制剂高通量筛选中 得到应用 [38] 。而果德安课题组设计的异构体特异性探针(N-乙基萘酰亚胺)可用于实时和 用研究、药物活性评价以及药效物质的筛选工作。本课题组前期 [43] 利用 Cmlc2-GFP 心肌特 异性荧光标记的斑马鱼品系，可以在荧光下直接观察心脏的形态和动态，用特非他定损伤 斑马鱼胚胎构建心律失常模型并对稳心颗粒的组分活性进行评价；Xia [44] 等人利用斑马鱼 胚胎发现常用中药补骨脂中的补骨脂素能通过氧化应激和能量代谢途径引起斑马鱼胚胎发 育畸形，揭示了补骨脂中的毒性物质，为临床应用提供了实验依据。 2.5 整体动物水平 整体动物模型最贴近生物实际情况，可以从整体水平观察药物效应、不良反应及毒性 作用，具备高可信度。但其实验成本较高，消耗的样品量较大，难以实现大量样品的筛选， 大多只对在分子、细胞等简单模型上已发现的中药活性物质进行药效评价和机制研究。 比如，Jiang [45] 等人建立了肾间质纤维化大鼠模型并验证了中药康仙灵抑制肾间质纤维 化的药效，实验结果支持了康仙灵在肾纤维化治疗中的临床应用；Pan [46] 等人从高糖高脂 饮食联合链脲佐菌素诱导的 2 型糖尿病大鼠模型中收集血清样本，通过测量生化标志物水 平评估了黄连汤的药效；课题组前期使用心肌缺氧复氧损伤的大鼠来模拟心肌缺血/再灌注 过程中的心脏损伤，通过心电超声、组织病理学等手段评估了通脉方对心血管疾病的治疗 效果。 表 1 不同筛选模型的优缺点 Table 1 Advantages and disadvantages of different screening models 基团，由于两者距离相近会发生 FRET 效应导致荧光淬灭，而当底物被催化后，供体与受 体分开，同一激发波长下最大发射波长处荧光强度增加，且与酶催化反应产物成正比。 Tian H [51] 等人基于荧光共振转移原理设计了一种依赖细胞的高通量 FRET 筛选方法，建立 表达基于 FRET 的生物传感器蛋白稳定的 HeLa 细胞系。细胞凋亡时激活 caspase-3 蛋白酶， 这种酶激活后会切割传感器蛋白，导致其荧光发射从 535 nm(绿色)波长转移到 486 nm (蓝色) 。通过绿/蓝发射比的降低直接表明细胞凋亡。利用这种方法从丹参等中药材种筛 选得到了能够诱导细胞凋亡的单体化合物。 3.1.3 荧光偏振法 荧光偏振 [52] 是研究水溶液中生物分子相互作用的一种强有力的荧光技术。荧光偏振， 或各向异性，是荧光分子的一种性质，可以使用荧光偏振仪器进行测量。利用偏振光激发 荧光样品，并收集平行于和垂直于偏振光电矢量通道的发射光强度。当荧光分子越小时， 其被偏振光激发时所偏转的角度就越随机，导致偏振值低，而当分子比较大时，被偏振光 照射时所偏转的角度不大，会导致偏振值高。所以当荧光小分子与生物大分子集合后其偏 振值会发生变化...…”