Absolute Quantifizierung nicht‐kodierender RNA‐Spezies mittels Mikroskala‐Thermophorese

Abstract

Die genaue Quantifizierung nicht-kodierender RNA-Spezies hat sich in jüngerer Zeit als dringendes Problem herauskristallisiert, das unter anderem Anwendung in der RNA-Modifikationsanalytik, der Untersuchung von Gewebedifferenzierung und vielen anderen Bereichen findet. Wir stellen hier einen hybridisierungsbasierten Ansatz vor,d er die Mikroskala-Thermophorese (MST) als sehr schnellesu nd hochpräzises Verfahren verwendet, um z. B. einzelne tRNA-Spezies mit einer Durchlaufzeit von etwa einer Stunde zu quantifizieren. Mithilfe der MST wurde u. a. die Wirkungv on tRNA-Toxinen, Hitzestress sowie von RNA-Modifikationen auf einzelnet RNA-Spezies untersucht. Eine vergleichende Analyse ergab weiterhin signifikante Unterschiede zu RNA-Seq-basierten Quantifizierungsansätzen, was auf eine Verzerrung letzterer aufgrund von tRNA-Modifikationen hindeutet. Weitere Anwendung fand die Methode bei der Bestimmung von rRNAsowie von PolyA-Fraktionen in zellulärer RNA.

High-resolution quantitative profiling of tRNA abundance and modification status in eukaryotes by mim-tRNAseq

“…In rapidly growing yeast cells, however, nearly all tRNA loci are transcribed (Harismendy et al, 2003;Roberts et al, 2003). tRNA gene copy number thus positively correlates with the abundance of tRNA anticodon families during exponential growth measured by hybridization (R 2 = 0.47 in microscale thermophoresis and R 2 = 0.60 in tRNA microarray; Jacob et al, 2019;Tuller et al, 2010). We leveraged the superior resolution of mim-tRNAseq to probe this relationship at the level of individual tRNA transcripts (Figure 3D).…”