O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de ácidos graxos (AG), os índices de qualidade nutricional e a estabilidade oxidativa (EO) de manteigas produzidas do leite de vacas alimentadas com dietas à base de cana-de-açúcar contendo níveis crescentes de óleo de girassol (OG): 0 (controle); 1,5; 3,0 e 4,5% da matéria seca (MS). O perfil de AG das manteigas foi analisado por cromatografia gasosa, e a EO foi determinada utilizando-se o equipamento Rancimat®, modelo 743, operado a 120ºC e fluxo de ar de 20L/h. As concentrações dos AG rumênico (CLA cis-9, trans-11), vacênico (C18:1 trans-11) e oleico (C18:1 cis-9) na gordura das manteigas foram aumentadas em 867, 687 e 148%, respectivamente, à medida que se aumentou de 0 para 4,5% o nível de OG na dieta. Por outro lado, as concentrações dos AG saturados de cadeia média foram linearmente reduzidas (P<0,0001) na gordura das manteigas, em razão do incremento de OG nas dietas. Quanto aos índices de qualidade nutricional, houve redução linear (P<0,0001) no índice de aterogenicidade e no de trombogenicidade e aumento da relação entre AG hipo e hipercolesterolêmicos, em resposta ao aumento do nível de OG na dieta. Consistente com o incremento (P<0,0001) nas concentrações totais dos AG mono e poli-insaturados, a EO da gordura das manteigas foi linearmente reduzida (P<0,0001) em razão do incremento de OG nas dietas. Concluiu-se que a suplementação com OG melhorou a qualidade nutricional das manteigas produzidas do leite de vacas Holandês x Gir devido a mudanças positivas no perfil de AG da gordura. Entretanto, tais mudanças na composição dos AG da gordura foram acompanhadas de redução da EO das manteigas, associada à menor vida de prateleira.