Una amplia variedad de antioxidantes evaluados en la congelación de semen equino no ha arrojado resultados satisfactorios en el mantenimiento de su calidad y fertilidad. El isoespintanol y el timol son moléculas de origen natural con una alta actividad antioxidante, lo que las hace potencialmente útiles para reducir el estrés oxidativo del semen durante la criopreservación. Este estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto del isoespintanol y el timol en la actividad antioxidante total y enzimática de semen equino diluido con fines de congelación. El semen de cinco caballos criollos colombianos se diluyó en un medio de congelación, se dividió en tres alícuotas que se asignaron aleatoriamente a los tratamientos isoespintanol (40 μM), timol (50 μM) o control (sin antioxidante). Se evaluó la capacidad antioxidante total (TAC) por los ensayos ORAC y FRAP. La actividad de catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD) y glutatión peroxidasa (GPx) se evaluaron mediante pruebas enzimáticas. La evaluación estadística se realizó mediante modelos mixtos, análisis de correlación y comparación de medias por la prueba de Tukey. Las actividades de SOD y GPx fueron menores para el isoespintanol (6,7 ± 2,2 U/ ml y 0,16 ± 0,02 U/ml), comparadas con el timol (6,9 ± 2,2 U/ml y 0,20 ± 0,02 U/ml) y el control (7,2 ± 2,2 U/ml y 0,22 ± 0,02 U/ml) (p < 0,05). No hubo diferencias para la TAC o la CAT del semen (p > 0,05). El isoespintanol reduce la actividad de SOD y GPx en el semen equino diluido con fines de congelación.