Pembuatan ikan asin layur (Trichiurus lepturus) menggunakan ikan air laut dari genus Trichiurus yang berpotensi mengandung bakteri halolifik. Ikan asin memiliki potensi besar sebagai sumber biomassa penghasil enzim protease yang tahan terhadap kadar garam tinggi (halostabil). Tujuan dari penelitian ini untuk mengetahui untuk mengetahui karakteristik dan genus, serta hubungan kekerabatan antar isolat bakteri halofilik penghasil protease dari ikan asin layur (T. Lepturus) di Pasar Beringharjo Yogyakarta. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif eksploratif dengan metode observasi. Pengambilan sampel ikan asin layur (T. lepturus) dilakukan pada 3 kios pedagang berbeda berdasarkan daerah hasil produksi pengolahan ikan asin tersebut. Sampel selanjutnya diisolasi pada media selektif Skim Milk Agar + 3% NaCl untuk menumbuhkan bakteri halofilik penghasil protease. Isolat bakteri yang didapatkan kemudian dimurnikan dan dilukan karakterisasi fenetik meliputi morfologi koloni dan sel, fisiologis (biokimia), serta kemampuan tumbuh pada kadar NaCl 0%, 10%, dan 20%. Data yang diperoleh digunakan untuk identifikasi dengan metode matching profile berdasarkan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Hubungan kekerabatan antar isolat bakteri diklasifikasikan menggunakan software MVSP 3.1 dengan algoritma pengklasteran UPGMA dan dikonstruksikan dalam bentuk dendogram. Hasil penelitian menunjukkan terdapat 7 isolat bakteri halofilik penghasil protease dari ikan asin layur (T. lepturus) yang berhasil diisolasi dari kios pedagang berbeda yaitu 3 isolat berasal dari kios A, 3 isolat berasal dari kios B, dan 1 isolat berasal dari kios C. konstruksi dendogram menunjukan 9 klaster bakteri. Terdapat 2 isolat bakteri yang memiliki indeks similaritas ≥ 83% terhadap acuan Staphylococcus sp. yaitu isolat A5 dan C6. Sebanyak 4 isolat bakteri yang memiliki indeks similaritas ≥ 67% terhadap Salinococcus sp. yaitu A6, A8, B5, dan B6. Serta 1 isolat bakteri yang memiliki indeks similaritas 83% terhadap strain acuan Halomonas sp. yaitu isolat B6.Kata kunci : Isolasi;Bakteri Halofilik;Proteolitik;Karakter FenetikIsolasi, Bakteri Halofilik, Proteolitik, Karakter Fenetik.