Aprimoramento da PCR para Mycoplasma gallisepticum pelo encurtamento do "amplicon" e ajustes no processamento da amostra

Abstract

A micoplasmose por Mycoplasma gallisepticum (MG) causa enormes prejuízos aos avicultores e, apesar disto, ainda carece de aprimoramento diagnóstico. O diagnóstico molecular, principalmente PCR, tem sido aprimorado pela facilidade em detectar o agente de forma direta e ser um método rápido e eficaz. Neste estudo, desenvolveu-se uma PCR para MG com "amplicon" de 481 pares de base (pb), denominado MG-PCR/481, no qual se utilizou um método simples de processamento das amostras, constituídas de cultivos de diferentes cepas de MG e suabes de traquéia de galinhas poedeiras de um plantel positivo para MG. Esse processamento, que não incluiu a etapa de purificação de DNA, consistiu de tratamento das amostras com uma mistura de dois detergentes não iônicos, digestão com protease e calor. A eficácia do MG-PCR/481, cujos "primers" foram oriundos da porção interna de um fragmento de 732 pb de DNA de MG que havia sido usado previamente para a elaboração do MG-PCR/732, com processamento envolvendo as etapas de extração e purificação. MG-PCR/732 com esse método de processamento foi capaz de detectar consistentemente um número de células de MG equivalente a 5.4 x 10 2 e inconsistentemente, um positivo em cinco tentativas, em se tratando de quantias inferiores. Por outro lado, MG-PCR/481 foi um logarítimo mais sensível que o anterior, sob as mesmas condições. Com suabe de traquéia, em estudo piloto, o MG-PCR/481 com este método de processamento também funcionou, pelo resultado de 70/% (7/10) obtido para as aves testadas. O MG-PCR/481 foi mais sensível que o outro com "amplicon" de 732 pares de base (MG-PCR/732), mantendo a mesma especificidade. De acordo com esses resultados, o MG-PCR/481 é apresentado como mais uma opção ao diagnóstico molecular da infecção por MG.

Occurrence of Avian Mycoplasmas in Free-Living Muscovy-Ducks (Cairina Moschata)

“…For molecular detection, a 0.5mL aliquot of the collected sample was submitted to DNA extraction by the phenol-chloroform adapted method (Sambrook & Russell, 2006). DNA amount and quality determination was performed in BiodropTouch ® (Biochrom, Harvard Bioscience, EUA) with subsequent PCR for the detection of Mollicutes class, MG, and MS according to Uphoff & Drexler (2002), Nascimento et al (2005a) and Lauerman et al (1993) respectively. The PCR for detection of Mollicutes was performed containing 1X PCR buffer (10mM Tris-HCl, pH 8.0 and 50mM of KCl), 2.0 mM of MgCl 2 , 0.8 mM of dNTP, 1U of Taq Polymerase (Ludwig, Brazil), 0.6 µM of each primer (Invitrogen, Brazil) and 5µL of DNA.…”