Introducción: El Estrés entendido como el conjunto de respuestas fisiológicas, comportamentales, emocionales y cognoscitivas, que resultan en el proceso de adaptación frente a las demandas derivadas de las condiciones de trabajo ante las cuales las personas evalúan que sus recursos de afrontamiento son insuficientes. Objetivo: Identificar el nivel de estrés laboral en personal con cargos asistenciales de cuatro instituciones de salud nivel III de la ciudad de Cali-Colombia. Materiales y métodos: El estudio fue de tipo descriptivo, con diseño transversal. Se aplicó el cuestionario para la evaluación del estrés tercera versión (Ministerio de la Protección Social (2010). La muestra fueron 595 participantes, con cargo asistencial que implica la atención sanitaria al paciente, en procedimientos de alta complejidad como cirugía, hospitalización, urgencias, cuidados intensivos. Resultados: Los resultados señalaron que el personal con cargo asistencial de las cuatro instituciones de salud nivel III presenta nivel alto de estrés laboral, concretamente en los síntomas fisiológicos, e intelectuales y laborales. Conclusiones: la prevalencia de estrés laboral en el personal asistencial puede asociarse con las características de rol, las condiciones laborales y la exposición permanente a enfermedades contagiosas propias del contexto de las instituciones de salud.