Biochemical characterization of a novel carboxypeptidase inhibitor from a variety of Andean potatoes

Lufrano, Daniela; Cotabarren, Juliana; García-Pardo, Javier; Fernandez‐Alvarez, Roberto; Tort, Olivia; Tanco, Sebastián; Avilés, Francesc X.; Lorenzo, Júlia; Obregón, Walter David

doi:10.1016/j.phytochem.2015.09.010

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“…The results of such kinetics analyses are summarized in Table 1. As expected, all tested MCP proteinaceous inhibitors, except for NvCI, inhibit hCPOΔC with K i values in the nanomolar range (PCI 3.2 ± 0.6 nM, LCI 12.8 ± 3.1 nM, TCI 16.7 ± 3.1 nM, and ACI 43.6 ± 6.3 nM), which are comparable to other members of the M14-A subfamily, such as hCPA1, hCPA2, and hCPB (28,33,34,42).…”

Section: Resultssupporting

confidence: 78%

“…The activity of MCPs can be specifically regulated by proteinaceous inhibitors (2). During the past 50 y, a number of such MCP inhibitors have been isolated and characterized so far from potato and tomato (PCI and MCPI, respectively) (27)(28)(29)(30), intestinal parasites Ascaris suum and Ascaris lumbricoides (ACI) (31,32), the medical leech Hirudo medicinalis (LCI) (33), ticks Rhipicephalus bursa and Haemaphysalis longicornis (TCI and H1TCI, respectively) (34,35), mammals (latexin) (36,37) and, more recently, from the marine annelid Sabellastarte magnifica (SmCI) (38) and sea snail Nerita versicolor (NvCI) (39). Among them, the latter inhibitor NvCI was found to be the most potent inhibitor discovered for members of the M14-A subfamily, displaying equilibrium dissociation constants in the picomolar range (39).…”

Section: Significancementioning

confidence: 99%

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Crystal structure and mechanism of human carboxypeptidase O: Insights into its specific activity for acidic residues

Garcia-Guerrero

García-Pardo

Berenguer

et al. 2018

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

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Human metallocarboxypeptidase O (hCPO) is a recently discovered digestive enzyme localized to the apical membrane of intestinal epithelial cells. Unlike pancreatic metallocarboxypeptidases, hCPO is glycosylated and produced as an active enzyme with distinctive substrate specificity toward C-terminal (C-t) acidic residues. Here we present the crystal structure of hCPO at 1.85-Å resolution, both alone and in complex with a carboxypeptidase inhibitor (NvCI) from the marine snail The structure provides detailed information regarding determinants of enzyme specificity, in particular Arg275, placed at the bottom of the substrate-binding pocket. This residue, located at "canonical" position 255, where it is Ile in human pancreatic carboxypeptidases A1 (hCPA1) and A2 (hCPA2) and Asp in B (hCPB), plays a dominant role in determining the preference of hCPO for acidic C-t residues. Site-directed mutagenesis to Asp and Ala changes the specificity to C-t basic and hydrophobic residues, respectively. The single-site mutants thus faithfully mimic the enzymatic properties of CPB and CPA, respectively. hCPO also shows a preference for Glu over Asp, probably as a consequence of a tighter fitting of the Glu side chain in its S1' substrate-binding pocket. This unique preference of hCPO, together with hCPA1, hCPA2, and hCPB, completes the array of C-t cleavages enabling the digestion of the dietary proteins within the intestine. Finally, in addition to activity toward small synthetic substrates and peptides, hCPO can also trim C-t extensions of proteins, such as epidermal growth factor, suggesting a role in the maturation and degradation of growth factors and bioactive peptides.

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Section: Resultssupporting

confidence: 78%

Section: Significancementioning

confidence: 99%

Crystal structure and mechanism of human carboxypeptidase O: Insights into its specific activity for acidic residues

Garcia-Guerrero

García-Pardo

Berenguer

et al. 2018

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

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“…A diferencia de las endoproteasas, las metalocarboxipeptidasas solo poseen unos pocos inhibidores peptídicos identificados y caracterizados en diferentes fuentes naturales: en la familia Solanaceae, en tomate (MCPI) y papa (PCI) (Rees andLipscomb 1982, Arolas 2007); en Solanum tuberosum grupo andigenum cv. Imilla morada (imaPCI) (Lufrano D. 2015); en el parásito intestinal Ascaris suum (ACI) (Sanglas 2009); en la sanguijuela medicinal Hirudo medicinalis (LCI) (Reverter 2000); en las garrapatas Rhipicephalus bursa (TCI) (Arolas 2005) y Haemaphysalis longicornis (HITCI) (Gong 2007); Nerita versicolor (NvCI) (Covaleda 2012); en tejidos de rata y humanos (latexina o ECI) (Normant 1995, Pallares 2005; y en el anélido marino Sabellastarte magnifica (SmCI) (Alonso-del-Rivero 2009).…”

Section: I32 Inhibidores De Metalocarboxipeptidasasunclassified

“…Se usaron patrones de pI de amplio rango (3,5-9,3) Como se puede apreciar en la Figura 1.12, en este rango de peso molecular (3750-4850 Da) no se observan prácticamente diferencias entre las proteínas que existen en el EC y en los tratamientos térmicos; por lo tanto, podemos decir que las moléculas de este rango de peso molecular, entre las cuales se podría hallar el inhibidor de interés, son estables a los tratamientos con calor. Este dato es muy importante ya que en este rango de pesos moleculares han sido estudiados distintos inhibidores de carboxipeptidasas (Hass, 1981;Lufrano, 2015 Da hasta los 100000 Da., pero en este caso no fue posible encontrar señal en el espectro. Esto se debe a que las proteínas más grandes y pesadas son difíciles de ver en un MALDI-TOF MS debido a su dificultad para ionizarse y posteriormente volar ("time of flight") hacia el detector de señales, lo cual no implica que las proteínas no se encuentren en la muestra.…”

Section: Estimación Del Punto Isoeléctricounclassified

“…Para verificar que la enzima inmovilizada mantiene su función correctamente, se realizó un seguimiento de actividad enzimática mediante espectrofotometría, similar al descripto en M&M para la enzima libre. En este caso, debió adicionarse al método un agitador magnético para mantener la enzima inmovilizada en suspensión, facilitándose de esta manera el acceso del sustrato a la enzima y la salida del producto para su lectura espectral (Suau T. 2009 (Ryan, 1974), 4234 Da (Lufrano, 2015). Hasta el momento se ha caracterizado un extracto de papas andinas variedad Churqueña con actividad inhibitoria de CPA.…”

Section: Diseño De Matrices Empleadas Para El Desarrollo De Cromatogrunclassified

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Purificación, clonación y expresión de inhibidores peptídicos de proteasas de potencial aplicación biomédica a partir de <i>Solanum tuberosum</i> spp.

Tellechea¹

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Los inhibidores de proteasas de naturaleza proteica son importantes moléculas reguladoras que inhiben la acción de enzimas proteolíticas y se encuentran extensamente distribuidos en diferentes tejidos de animales, plantas y microorganismos. En su gran mayoría, los inhibidores de proteasas presentes en la naturaleza son proteicos, con la excepción de pequeños inhibidores de microorganismos. Estas moléculas han demostrado su acción en el tratamiento de diferentes patologías en las cuales la desregulación en la acción de las proteasas puede conducir a desequilibrios fisiológicos que llevan a la muerte celular. El presente trabajo de tesis doctoral tiene como objetivo el estudio de nuevas miniproteínas inhibidoras de carboxipeptidasas de tipo “cystine knot” a partir de extractos de tubérculos de Solanum tuberosum grupo andígenum variedada Churqueña. Para este propósito se aplicaron una diversidad de técnicas tales como la espectrometría de masas, biología molecular, expresión recombinante de proteínas, ensayos enzimáticos y caracterización del plegamiento oxidativo. Dentro de estas técnicas, la espectrometría de masas ha sido de gran importancia en este trabajo la cual fue de utilidad en la identificación, caracterización y validación de las moléculas estudiadas. El trabajo se encuentra dividido en tres capítulos a través de los cuales se presentan los resultados obtenidos. En el primer capítulo se describe el estudio y caracterización de un extracto crudo de tubérculos de papa andina determinando su actividad inhibitoria frente a proteasas de diferente tipo mecanístico. Se estudió la estabilidad térmica de los inhibidores de carboxipeptidasas presentes en el extracto y se determinaron los pesos moleculares de las proteínas resistentes a este tratamiento térmico mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Además, se utilizó una técnica proteómica, denominada Intensity Fading MALDI-TOF, mediante la cual se verificó la interacción de moléculas presentes en el extracto con carboxipeptidasa A. Por último, se purificó una molécula que produce inhibición de carboxipeptidasa A mediante cromatografía de afinidad y se realizó un análisis de la huella peptídica o PMF (Peptide Mass Fingerprinting) para su identificación de su secuencia primaria en bases de datos. En el segundo capítulo se presenta el estudio de dos miniproteínas con potencial actividad inhibitoria de carboxipeptidasas. Para llevarlo a cabo, ambas proteínas se expresaron de forma recombinante, se determinó su actividad inhibitoria y se realizaron estudios de plegamiento oxidativo. Además se presentan en este capítulo, modelos estructurales de una de las miniproteínas expresadas utilizando herramientas bioinformáticas. En el tercer capítulo, se aisló desde un brote de tubérculo de Churqueña el ARNm de un tercer inhibidor de carboxipeptidasa. En este capítulo, se muestran los resultados de la expresión recombinante y purificación de este inhibidor, y se presenta su actividad inhibitoria frente a carboxipeptidasas A y B. Asimismo, se describe la identificación de la proteína nativa en el extracto de papa mediante técnicas proteómicas como PMF-MALDI-TOF MS y secuenciación de novo PMF-MALDI-TOF-TOF/MS/MS.

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Leech, potato, and tomato carboxypeptidase inhibitors against Anopheles stephensi carboxypeptidase B1 and B2

Rismani,

Mafakher,

Asgari

et al. 2024

Archives of Biochemistry and Biophysics

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Biochemical characterization of a novel carboxypeptidase inhibitor from a variety of Andean potatoes

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Crystal structure and mechanism of human carboxypeptidase O: Insights into its specific activity for acidic residues

Crystal structure and mechanism of human carboxypeptidase O: Insights into its specific activity for acidic residues

Purificación, clonación y expresión de inhibidores peptídicos de proteasas de potencial aplicación biomédica a partir de <i>Solanum tuberosum</i> spp.

Leech, potato, and tomato carboxypeptidase inhibitors against Anopheles stephensi carboxypeptidase B1 and B2

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