Cloning and analysis of biochemical and catalytic properties of DNA methyltransferase M1.BspACI

Abstract

Гены ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BspACI из Bacillus psychrodurans AC клонировали в клетках E. coli. Анализ аминокислотных последовательностей белков, кодируемых этими генами, показал, что они оба относятся к классу С5 ДНК-метил-трансфераз. Ген M1.BspACI субклонировали в составе экспрессирующего вектора pJW2. Препарат высокоочищенного рекомбинантного фермента получали с помощью хроматогра-фии на различных носителях. Установлено, что M1.BspACI модифицирует первый цито-зин в последовательности 5ґ-CCGC-3ґ. Определены кинетические параметры реакции ме-тилирования ДНК ферментом и показано, что каталитическая константа оказалась равной 0,095 ± 0,002 мин -1 , K m ДНК фага l -0,053 ± 0,007 мкМ, K m SAM -5,1 ± 0,3 мкМ. ДНК-метилтрансферазы (метилазы, М) -сайт-специфические ферменты, катализирующие перенос метильной группы от донора, S-аденозил-L-метио-нина (SAM), на адениновое или цитозиновое осно-вание в определенной нуклеотидной последователь-ности. У прокариотических организмов, как правило, эти ферменты вместе с эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами, R) образуют системы рестрикции-модификации (RМ-системы), основной функцией ко-торых является защита клетки от чужродной ДНК. Большинство RM-систем с несимметричными узна-ваемыми последовательностями (подтип IIS) вклю-чают чаще всего две ДНК-метилтрансферазы, каждая из которых модифицирует лишь одну из цепей ДНК.Ранее нами был выявлен штамм Bacillus psychrodurans AC, который продуцирует эндонуклеазу рестрикции, узнающую непалиндромную последова-тельность 5ґ-CCGC-3ґ [1]. В представленной работе описано клонирование, выделение, биохимические и субстратные свойства рекомбинантной ДНК-ме-тилтрансферазы M1.BspACI. Методы исследованияКлонирование генов метилтрансфераз РМ системы BspACI выполнялось со-гласно стандартным методам [2]. Сум-марная плазмидная ДНК, состоящая из PstI-и Zsp2I-фрагментов хромосомной ДНК Bacillus psychrodurans AC в соста-ве плазмидного вектора pUC19, обраба-тывалась рестриктазой BspACI и транс-формировалась в клетки E. coli ER2267. Плазмида одного из полученных таким образом клонов использовалась для субклонирова-ния гена метилтрансферазы в составе вектора pJW2 по сайтам рестрикции FauNDI и BamHI. Получен-ные клоны подвергали термоиндукции и наблюдали появление полосы, соответствующей целевому бел-ку, в 10%-м SDS-полиакриламидном геле.Выделение рекомбинантной M1.BspACI прово-дили путем последовательной хроматографической очистки на колонках с использованием следующих носителей: фосфоцеллюлозы P-11, гидроксилаппати-та -для второй и пятой стадий, гепарин-сефарозы, сефакрила S-200. Наличие активной M1.BspACI в профиле определяли по защите ДНК фага l от гид-ролиза рестриктазой BspACI (инкубированной с алик-вотами из фракций). Отсутствие примесных белков в готовом препарате контролировали с помощью электрофореза в 10%-м SDS-полиакриламидном геле. Оптимальную температуру, рН и концентрацию ионов калия и натрия определяли по интенсивно-сти включения меченного SAM за 60 мин реакции.Определение метилируемого основания в сайте узнавания M1....