No abstract

Goal of the study. To study the role of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines for the course of atopic dermatitis (AD). Materials and methods. The study involved 72 patients aged 25-55 suffering from atopic dermatitis for 2-30 years and with at least two relapses a year. The AD patients were assigned to the following groups depending on the SCORAD (iSc) index: Group 1: light form (iSc < 30 points), Group 2: moderate to severe form (iSc from 30 to 50 points) and Group 3: severe form (iSc > 50 points). The control group comprised 23 practically healthy subjects aged 25-35. The level of cytokines (IL-1 β, -4, -6, -8, -10, -12, -13, TNF-α and IFN-γ) in blood serum was determined based on the immune-enzyme assay method. Results. A trend to the increased production of anti-inflammatory cytokines (IL-4, -6, -10, -13) at the exacerbation stage and increased synthesis of pro-inflammatory ones (IFN-γ, TNF-α and IL-12) at the remission stage was observed in patients with atopic dermatitis, which confirms the dysregulation of reciprocal relationships between Th1 and Th2 lymphocyte subpopulations during the disease.

Показано повышение активности лейкоцитарной эластазы у пациентов с атопическим дерматитом, которое коррелировало со степенью тяжести данного заболевания. Однако это не всегда сопровождалось адекватным повышением активности α1-протеиназного ингибитора. Есть основания полагать, что сниженная активность α1-ПИ является неблагоприятным прогностическим признаком течения АД, способствующим дальнейшему прогрессированию деструктивного процесса. Leukocyte elastase activity has been shown to be increased in patients with atopic dermatitis and to correlate with the disease severity. However, this increase is not always accompanied by an adequately increased activity of the α1-proteinase inhibitor (α1-PI). Evidence suggest that the decreased α1-PI activity is an unfavorable prognostic sign of changes in BP that contribute to further progression of the destructive process.

Гены ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BspACI из Bacillus psychrodurans AC клонировали в клетках E. coli. Анализ аминокислотных последовательностей белков, кодируемых этими генами, показал, что они оба относятся к классу С5 ДНК-метил-трансфераз. Ген M1.BspACI субклонировали в составе экспрессирующего вектора pJW2. Препарат высокоочищенного рекомбинантного фермента получали с помощью хроматогра-фии на различных носителях. Установлено, что M1.BspACI модифицирует первый цито-зин в последовательности 5ґ-CCGC-3ґ. Определены кинетические параметры реакции ме-тилирования ДНК ферментом и показано, что каталитическая константа оказалась равной 0,095 ± 0,002 мин -1 , K m ДНК фага l -0,053 ± 0,007 мкМ, K m SAM -5,1 ± 0,3 мкМ. ДНК-метилтрансферазы (метилазы, М) -сайт-специфические ферменты, катализирующие перенос метильной группы от донора, S-аденозил-L-метио-нина (SAM), на адениновое или цитозиновое осно-вание в определенной нуклеотидной последователь-ности. У прокариотических организмов, как правило, эти ферменты вместе с эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами, R) образуют системы рестрикции-модификации (RМ-системы), основной функцией ко-торых является защита клетки от чужродной ДНК. Большинство RM-систем с несимметричными узна-ваемыми последовательностями (подтип IIS) вклю-чают чаще всего две ДНК-метилтрансферазы, каждая из которых модифицирует лишь одну из цепей ДНК.Ранее нами был выявлен штамм Bacillus psychrodurans AC, который продуцирует эндонуклеазу рестрикции, узнающую непалиндромную последова-тельность 5ґ-CCGC-3ґ [1]. В представленной работе описано клонирование, выделение, биохимические и субстратные свойства рекомбинантной ДНК-ме-тилтрансферазы M1.BspACI. Методы исследованияКлонирование генов метилтрансфераз РМ системы BspACI выполнялось со-гласно стандартным методам [2]. Сум-марная плазмидная ДНК, состоящая из PstI-и Zsp2I-фрагментов хромосомной ДНК Bacillus psychrodurans AC в соста-ве плазмидного вектора pUC19, обраба-тывалась рестриктазой BspACI и транс-формировалась в клетки E. coli ER2267. Плазмида одного из полученных таким образом клонов использовалась для субклонирова-ния гена метилтрансферазы в составе вектора pJW2 по сайтам рестрикции FauNDI и BamHI. Получен-ные клоны подвергали термоиндукции и наблюдали появление полосы, соответствующей целевому бел-ку, в 10%-м SDS-полиакриламидном геле.Выделение рекомбинантной M1.BspACI прово-дили путем последовательной хроматографической очистки на колонках с использованием следующих носителей: фосфоцеллюлозы P-11, гидроксилаппати-та -для второй и пятой стадий, гепарин-сефарозы, сефакрила S-200. Наличие активной M1.BspACI в профиле определяли по защите ДНК фага l от гид-ролиза рестриктазой BspACI (инкубированной с алик-вотами из фракций). Отсутствие примесных белков в готовом препарате контролировали с помощью электрофореза в 10%-м SDS-полиакриламидном геле. Оптимальную температуру, рН и концентрацию ионов калия и натрия определяли по интенсивно-сти включения меченного SAM за 60 мин реакции.Определение метилируемого основания в сайте узнавания M1....

Нейтрофилы периферической крови играют важную роль в патогенезе атопического дерматита. При обострении атопического дерматита изменяется экспрессия рецепторов на поверхности нейтрофилов и сопряженные с ними сигнальные пути. Цель исследования - изучение экспрессии рецепторов семейства TREM (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells) на поверхности нейтрофилов и моноцитов периферической крови взрослых людей в начале периода обострения заболеания. Методика. В исследовании приняли участие 70 больных атопическим дерматитом и 22 здоровых донора. Кровь брали из локтевой вены натощак в вакутейенеры с ЭДТА. После удаления эритроцитов лизирующим буфером (Becton Dickinson) лейкоциты окрашивали моноклональными антителами к специфическим рецепторам нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов (BD-bioscience, Germany), а также к рецепторам TREM-1 и sTREM-1 (R&D System, Minneapolis, MN, USA), и TREM-2 (Abcam, UK). Флуоресценцию клеток анализировали на проточном цитометре FACSCalibur по программе CellQuest. При анализе флуоресценции нефракционированных клеток сначала устанавливали гейты основных популяций на каналах FSC/SSC. Затем выделяли гейт нейтрофилов и в нем анализировали экспрессию рецепторов на каналах FL-1A/FL-2A (CD16/TREM-1 и CD16/TREM-2). Определяли процент антиген-положительных клеток и интенсивность флуоресценции в условных единицах. Экспрессию рецепторов TREM-1 и TREM-2 на моноцитах измеряли аналогично в гейте моноцитов. Концентрацию растворимого рецептора sTREM-1 в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом с помощью антител (R&D System, Minneapolis). Результаты. Показано повышение экспрессии рецепторов TREM-1 в ранний период обострения атопического дерматита, положительно коррелирующее со степенью активности процесса. Установлено статистически значимое повышение экспрессии рецепторов TREM-2 на нейтрофилах периферической крови больных на ранней стадии обострения по сравнению с донорами и пациентами в стадии ремиссии. Показано, что повышение экспрессии растворимого рецептора sTREM-1 в клетках нейтрофилов, а также повышение его концентрации в сыворотке крови положительно коррелирует с тяжестью течения атопического дерматита по индексу SCORAD. Экспрессия рецепторов TREM-1 на нейтрофилах повышается как при стимуляции клеток бактериальными пептидами, так и при контаминации кожи бактериями, но в любом случае TREM-1 поддерживает воспаление и коррелирует с тяжестью течения атопического дерматита. Заключение. Комплексный анализ экспрессии рецепторов семейства TREM позволяет оценить степень активности воспалительного процесса при атопическом дерматите. Peripheral blood neutrophils play an important role in the pathogenesis of atopic dermatitis (AD). AD exacerbation induces changes in the neutrophil surface receptor expression and coupled signaling pathways. Aim of this work was to evaluate TREM (triggering receptor expressed on myeloid cells) receptor expression on neutrophils and monocytes in peripheral blood of adult patients with AD at the beginning of exacerbation period. Methods: This study included 70 patients with AD and 22 healthy donors. Blood was withdrawn from the cubital vein in fasting state and collected in vacutainers with EDTA. Following removal of red blood cells with a lysing buffer (Becton Dickinson) leukocytes were stained with monoclonal antibodies to specific receptors of neutrophils, lymphocytes, and monocytes (BD Bioscience, Germany) and to TREM-1, sTREM-1 (R&D System, Minneapolis, MN, USA), and TREM-2 (Abcam, UK) receptors. Cell fluorescence was analyzed using a FACSCalibur flow cytometer with CellQuest software. In analyzing fluorescence of unfractionated cells, gates of major populations were set on FSC/SSC channels. The neutrophil gate was isolated, and receptor expression was analyzed on FL-1A/FL-2A channels (CD16/TREM-1 and CD16/TREM-2). Proportion of antigen-positive cells was determined; fluorescence intensity was measured in conventional units. TREM-1 and TREM-2 receptor expression on monocytes was measured by the same method in the monocyte gate. Serum concentration of soluble sTREM-1 receptor was measured by enzyme immunoassay with antibodies (R&D System, Minneapolis). Results. Elevated TREM-1 receptor expression was observed in the early period of AD exacerbation and positively correlated with AD severity. The expression of TREM-2 receptors on peripheral blood neutrophils was significantly increased in patients with early exacerbation of AD compared to donors and patients in remission. Increased expression of the sTREM-1 soluble receptor on neutrophils and its increased serum concentration positively correlated with AD severity. The TREM-1 receptor expression on neutrophils was increased after either a bacterial peptide exposure or stimulation of immune response by skin bacteria. In both cases, TREM-1 supported inflammation and correlated with AD severity. Conclusion: A comprehensive analysis of the TREM family receptor expression allows assessing the intensity of inflammation process in atopic dermatitis.