Latar belakang. Infeksi saluran kemih (ISK) merupakan salah satu penyakit infeksi yang sering ditemukan pada anak usia 2 bulan hingga 2 tahun. Kondisi ini sulit dideteksi karena manifestasi klinis yang tidak spesifik. Kultur urin sebagai baku emas menegakkan diagnosis ISK membutuhkan waktu yang lama dan biaya yang mahal. Pewarnaan Gram urin adalah metode yang mungkin dapat digunakan untuk diagnosis dini ISK pada bayi dan anak. Tujuan. Membandingkan metode pewarnaan Gram dan kultur urin untuk mendiagnosis ISK pada anak usia 2 bulan hingga 2 tahun. Metode. Penelitian ini merupakan uji diagnostik dengan metode potong lintang di Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo, Jakarta, Indonesia, dari Mei 2016 -Desember 2017. Penelitian ini melibatkan 59 anak usia 2 bulan hingga 2 tahun yang dicurigai menderita ISK yang direkrut dengan metode consecutive sampling. Sampel urin diambil dengan kateterisasi uretra dan dilakukan pemeriksaan urinalisis, pewarnaan Gram, dan pemeriksaan biakan urin. Hasil. Prevalens ISK didapatkan sebesar 38,9%. Pewarnaan Gram urin memiliki sensitivitas 47,8% (95% IK 26,8-69,4%), spesifisitas 97,2% (95% IK 85,5-99,9%), nilai duga positif 91,7% (95% IK 60,3-98,8%), nilai duga negatif 74,5% (95% IK 60,3-98,8%), LR(+) 17,2 (95% IK 2,4-124,6), LR(-) 0,54 (95% IK 0,36-0,8), dan akurasi sebesar 78%. Kesimpulan. Terdapat korelasi yang baik antara pewarnaan Gram urin dan hasil biakan urin untuk mendiagnosis ISK pada anak usia 2 bulan hingga 2 tahun. Antibiotik dapat segera diberikan setelah pewarnaan Gram menunjukkan hasil positif.