Current Methods of microRNA Analysis

Abstract

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie, Masarykův onkologický ústav, Brno Souhrn Východiska: I mikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující molekuly RNA regulující genovou expresi vazbou na mRNA. Ovlivňují řadu fyziologických procesů, vč. buněčné proliferace, diferenciace nebo apoptózy, a mají tak výrazný vliv na vývoj nádorových i jiných onemocnění. Představují proto slibnou skupinu nádorových bio markerů využitelných např. v časné dia gnostice, v predikci odpovědi na léčbu, při záchytu relapsu nebo při klasifikaci nádorů do molekulárních subtypů. Cíl: Detekce miRNA vyžaduje různé sofistikované strategie zejména kvůli jejich krátké délce, značné sekvenční podobnosti mezi miRNA patřící do stejné rodiny, i pro jejich často velmi nízkou hladinu ve studovaném vzorku. V této práci jsou zmíněné standardně používané metody, např. reverzní transkripce s následnou polymerázovou řetězovou reakcí, microarrays nebo sekvenování nové generace, a rovněž jsou porovnány různé komerčně dostupné sady pro detekci miRNA. Hlavní důraz je kladen na nově vyvíjené technologie a metody, které by mohly současnou analýzu zlevnit nebo urychlit. Představeny jsou např. alternativní amplifikační techniky (izotermální amplifikace, hybridizační řetězová reakce), různé typy nanomateriálů, speciální proteiny se schopností vázat miRNA, a řada bio senzorů využívající optickou nebo elektrochemickou detekci. Závěr: Důležitost miRNA vedla k obrovskému nárůstu počtu nově vyvíjených metod. Většina z nich ovšem nebyla testována na klinickém materiálu, takže je těžké určit jejich eventuální aplikovatelnost do praxe. Pro komerční využití nových metod bude proto nutné provést jejich přísnou validaci pomocí standardních metod nejenom na modelových systémech, ale zejména u klinických vzorků. Klíčová slova mikroRNA-regulace genové exprese-nádorové bio markery-RT-PCR-bio senzory Summary Background: MicroRNA (miRNA) are a class of short non-coding RNA molecules that regulate gene expression at the post-transcription level by binding to mRNA. By affecting many physiological processes, including cellular proliferation, differentiation, and apoptosis, they have a major impact on the development of cancer as well as other diseases. Hence, miRNAs could serve as potential tumor biomarkers in e.g. early diagnostics, predicting responses to therapy, monitoring relapse, and molecular classification of tumors. Aim: miRNA detection requires various sophisticated strategies due to the small size, sequence similarity among family members, and often very low levels of miRNAs in analyzed samples. This review describes standard techniques of miRNA detection, such as the reverse transcriptase polymerase chain reaction, microarrays, and next-generation sequencing, and compares several commercially available detection kits. Major emphasis is given to newly developed technologies and methods, which could make the analysis cheaper and quicker. We present, for instance, alternative amplification techniques (isothermal amplification and the hybridization chain reaction), differ...

MiRNAs and radical prostatectomy: Current data, bioinformatic analysis and utility as predictors of tumour relapse

“…High‐scale miRNA analysis is a possible prospect for PCa development diagnostics, as it provides a significant number of data regarding different miRNA expressions, as well as multiple tools for data normalisation. However, in practice, reproducibility, costs, time‐investments and limited data analysis applications of the procedure should be noted 47,50 . All these methods are based on different microarrays or NGS and represent the best option as a hypothesis‐independent approach to identify the primary set of potential miRNA markers.…”

“…However, in practice, reproducibility, costs, time-investments and limited data analysis applications of the procedure should be noted. 47,50 All these methods are based on different microarrays or NGS and represent the best option as a hypothesis-independent approach to identify the primary set of potential miRNA markers. The data obtained must be validated by other methods, and quantitative RT-PCR is currently the most convenient protocol for this task.…”

Electrochemical Analysis of Clinical Samples – A Path to Translational Research

“…Obecně je detekce biomarkerů na úrovni nukleových kyselin, tj. DNA nebo RNA, časově i finančně náročná a často vyžaduje přesnost stanovení jednoho mutovaného nukleotidu nebo detekci několika málo kopií DNA molekul [3][4][5][6] . Z těchto důvodů je patrný výrazný trend ve vývoji biosenzorů, které ve spojení s citlivou elektrochemickou detekcí skýtají řadu výhod, např.vyšší rychlost, nižší finanční a instrumentální náročnost, nebo možnost paralelní detekce více vzorků či biomarkerů najednou.…”

“…Molekuly miRNA dělíme nejčastěji do dvou skupin, a to na tumor supresorové a onkogenní; tumor supresorové miRNA tlumí expresi onkogenů, a oproti zdravé tkáni tak mají v nádorech výrazně sníženou hladinu. Naopak onkogenní miR-NA jsou v nádorech nadměrně exprimovány a jejich hladiny jsou vyšší v porovnání se zdravou tkání 3 . Současné metody detekce miRNA, např.…”

The Impact of Air Pollution Exposure on the MicroRNA Machinery and Lung Cancer Development

“…To date, three major methodological strategies of miRNA analysis have been used. They are based on amplification, hybridization, or sequencing protocols [ 8 , 9 , 10 ]. Their choice for individual studies strongly depends on the aim of the experiment, the quality and quantity of samples as well as on the budget of the researcher.…”