Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kualitas kimia bakso daging sapi yang disubstitusi dengan daging ikan tuna (Thunnus sp). Daging sapi (otot Biceps femoris) dan daging ikan tunal, dihaluskan terpisah untuk pembuatan bakso dengan komposisi 70,00% daging sapi, 16,00% tepung tapioka, 9,00% air es, 2,00% garam, 2,20% bawang putih, dan 0,80% lada. Daging sapi disubstitusi dengan daging ikan tuna dengan level 0%, 20%, dan 40%, kemudian semua bahan digiling halus hingga tercampur merata membentuk adonan. Adonan bakso dibentuk bulat (diameter ± 2 cm) secara manual dengan tangan, kemudian direbus hingga matang (sampai bakso mengapung). Bakso diangkat dan ditiriskan. Parameter yang diuji yaitu kualitas kimia (kadar air, protein, lemak, dan abu). Data yang diperoleh, dianalisis sidik ragam menggunakan rancangan acak lengkap, dengan 3 perlakuan level daging ikan tuna (0%, 20%, dan 40%), masing-masing 5 ulangan. Perbedaan antar perlakuan akan diuji lanjut dengan uji DMRT. Hasil penelitian menunjukkan bahwa daging sapi yang disubstitusi dengan daging ikan tuna, meningkatkan (P<0,01) kadar air dan kadar lemak bakso, tetapi menurunkan (P<0,01) kadar protein bakso. Dapat disimpulkan bahwa daging sapi dapat disubstitusi dengan daging ikan tuna dalam pembuatan bakso, yang berdampak pada peningkatan kadar air dan kadar lemak, tetapi menurunkan kadar protein bakso.