Die Funktion von NLP1 im CRM1-abhängigen Protein-Export aus dem Zellkern

Abstract

Der Export der meisten Proteine aus dem Zellkern ins Cytosol erfolgt unter Beteiligung des Exportfaktors CRM1. Dieser erkennt einen hydrophoben Bereich des zu exportierenden Proteins (NES = nuclear export signal), bindet ihn in Gegenwart von RanGTP und vermittelt anschließend den Durchtritt durch die Kernpore. Die meisten NES-Substrate besitzen eine relativ geringe Affinität zu CRM1. In den letzten Jahren wurden jedoch Proteine entdeckt, die als Hilfsfaktoren für den Export fungieren indem sie die Bindungsaffinität zwischen CRM1, RanGTP und dem Exportsubstrat erhöhen. Ein Ziel dieser Doktorarbeit war es herauszufinden, warum in der Zelle Hilfsfaktoren für den CRM1-abhängigen Export vorhanden sind. In vivo-Analysen basierend auf der Überexpression unterschiedlicher Reporterproteine in humanen Zellen zeigten, dass die Exporteffizienz dieser Proteine in Zellen, die mit CRM1 co-transfiziert waren, signifikant erhöht war. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Konzentration des Exportfaktors CRM1 für den CRM1-vermittelten Proteinexport limitierend ist und leitet zu der Annahme, dass Hilfsfaktoren den Export deshalb unterstützen können. Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Analyse des Proteins NLP1 (nucleoporin like protein 1). Da andere Gruppen mittels Hefe-zwei-Hybrid-Analysen eine Interaktion zwischen CRM1 und NLP1 nachgewiesen hatten, sollte nun die Funktion von NLP1 im CRM1-abhängigen Proteinexport näher untersucht werden. Es konnte in vivo mittels konventioneller Mikroskopie und FLIP-Analysen gezeigt werden, dass die Überexpression von NLP1 in humanen Zellen eine Verstärkung des Exports verschiedener Reporterproteine hervorrief, während die Depletion von NLP1 zu einer Verminderung des Exports führte. Auch in vitro verstärkte die Zugabe von rekombinantem NLP1 den Export von GFP-NFAT in Digitonin-permeabilisierten Zellen. Somit konnte NLP1 erstmals eine fördernde Rolle im CRM1-abhängigen Proteinexport zugeordnet werden. Hinweise darauf, wie NLP1 den Export von Substraten fördern kann, gaben biochemische Analysen. Sie zeigten, dass NLP1 trimere bzw. tetramere Komplexe mit CRM1 und RanGTP in An-oder Abwesenheit eines Exportsubstrates bilden kann. Dies förderte zum einen die Bindung von CRM1 zu RanGTP und verstärkte zusätzlich die Interaktion zwischen CRM1 und dem Exportsubstrat. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen NLP1 eine stimulierende Funktion im CRM1abhängigen Export von Proteinen zu, die der Zelle Möglichkeiten zur Regulation dieses Transportweges eröffnen könnte.