Diseño de cebadores específicos para la detección por RT-PCR del <i>Potato Virus</i> Y (PVY)

Abstract

El Potato virus Y (PVY) es uno de los virus más limitantes para la producción de papa (Solanum tuberosum y S. phureja) en el mundo. Este virus es transmitido por tubérculo-semilla de papa y por diferentes especies de áfidos. Para su manejo es fundamental la siembra de tubérculos certificados por su sanidad viral, para lo que se requieren metodologías de detección altamente sensibles como ELISA y RT-PCR. Para éstas últimas pruebas, es necesario disponer de cebadores específicos que permitan el diagnóstico del virus en tejidos asintomáticos. En este estudio se reportan los cebadores PVY_Col para la detección del PVY en RT-PCR convencional y en tiempo real (RT-qPCR). Estos cebadores fueron diseñados con base en las secuencias de este virus que se han reportado en Colombia sobre diferentes hospedantes, así como de las diferentes variantes encontradas en el mundo. Una particularidad adicional de estos cebadores es que no presentan reacción cruzada con el genoma del Potato virus V (PVV), otro potyvirus que recientemente se ha encontrado afectando cultivos de papa en Colombia. Se espera que los cebadores PVY_Col sean utilizados para apoyar los programas de certificación de material de siembra de papa, así como para adelantar estudios epidemiológicos y de manejo fitosanitario de este virus.

Prevalencia de cinco virus de ARN en tubérculos-semilla de papa cultivados en Antioquia (Colombia)

“…La síntesis del ADN complementario (ADNc) se realizó en un volumen de 20 μL a 42°C por 1 h a partir de 200 U de la enzima RevertAid Reverso Transcriptasa (RT) (Thermo-Fisher Scientific), 1X de buffer RT, 0,5 mM de dNTPs, 20 U de RiboLock inhibidor de ARNasas, 100 ng de ARN total y 100 pmol de cada primer reverso, que para el caso de PVY, PVS y PVX correspondió al Oligo-(dT)18; mientras que para PYVV se usó el primer qPYVV_R_CP (5' AGG TCT CAG GAT CTG GAT CAA CT 3') [12] y para PLRV el primer PLRV-R (5' GCA ATG GGG GTC CAA CTC CAA CTC AT 3') [13]. En la amplificación mediante PCR en tiempo real (qPCR) se empleó el kit Maxima SYBR Green/ROX (Thermo-Fisher Scientific) con 50-100 ng de ADNc y 0,3 μM de los primers específicos PVY-1_FP (5´ CCA ATC GTT GAG AAT GCA AAA C 3´) y PVY-1_RP (5´ ATA TAC GCT TCT GCA ACA TCT GAG A 3´) [14], PVS_gen_F (5' ATG CCG CCY AAA CCA GAT CC 3') y qPVS_gen_R (5' AGC ATK GCT TCY TCA TTT TGC CCT G 3') [15], PVX_101-2_FP (5' AAG CCT GAG CAC AAA TTC GC 3') y PVX_101-2 RP (5' GCT TCA GAC GGT GGC CG 3') [16], PYVV_F_CP (5' TCA GGT TAG AGC AGA CAG AGG 3') y qPYVV_R_CP [14] y PLRV-Sense (5´ GCT CAA GCG AGA CAT TCG TG 3´) y PLRV-Antisense (5´ TTG AAT GCC GGA CAG TCT GA 3´) [17]. El programa de amplificación consistió de un paso de activación de la enzima a 95°C por 10 min, seguido de 35 ciclos a 95°C por 15 s y 52°C por 45 s, en un equipo Rotor-Gene Q-5plex (Qiagen, Alemania).…”

Evaluación de métodos para la inoculación y diagnóstico del virus del mosaico del pepino (CMV)

“…Por otro lado, los altos niveles de identidad encontrados en este estudio por secuenciación (99%), coinciden con los reportados por Riascos et al [41] y Mejía et al [42], quienes identificaron virus vegetales usando RT-PCR y secuenciación de fragmentos de PCR, mostrando alta sensibilidad de detección viral entre las metodologías moleculares evaluadas. A pesar que los resultados de RT-PCR confirmaron la presencia viral en este estudio, Figura 4.…”