Na aquicultura (peixes, répteis, anfíbios e crustáceos), a ocorrência de enfermidades é uma preocupação constante, devido à rápida multiplicação de agentes patogênicos (bactérias, fungos, vírus e parasitas). Por esta razão, medidas adequadas de manejo e sanidade que visam segurança dos alimentos e o controle de patógenos devem ser constantes para o sucesso dessa atividade agropecuária. A Francisella spp. é um gênero bacteriano que causa uma doença granulomatosa conhecida por sua alta mortalidade em tilápia do Nilo cultivada comercialmente. Já o Mycobacterium spp. agente etiológico da tuberculose em peixes, é doença com significativa relevância para a saúde pública, devido ao seu caráter zoonótico. O objetivo do presente estudo foi identificar a presença de ambos os gêneros bacterianos em pisciculturas comerciais de tilápia-do-Nilo, bijupirás e trutas localizadas no sudeste do Brasil, por meio de técnicas de histopatologia, isolamento bacteriano, PCR, imunohistoquímica e hibridização in situ. Um total de 128 amostras clínicas (rim, fígado e baço) foram processadas para histologia, isolamento bacteriano, imunohistoquímica usando anticorpos policlonais e hibridização in situ com sondas biotiniladas específicas. Para a PCR, as amostras foram processadas utilizando os mesmos primers utilizados para a hibridização in situ, porém não biotiniladas. Na histologia em relação ao total das amostras, 46% (59/128) apresentaram granulomas, hemorragia em 67,9% (87/128), centros de melanomacrófagos em 85,9% (110/128) e presença de eosinófilos em 59,3% (76/128) no rim, baço e/ou hepatopâncreas. Já pela coloração de Fite-Faraco, 47,6% (61/128) das amostras apresentaram bacilos sugestivos de Mycobacterium. No isolamento bacteriano de Francisella spp., nenhuma das amostras foi positiva, e em relação a Mycobacterium spp., em 6,25% (8/128), das amostras houve crescimento de colônias, sendo identificadas duas espécies: M. fortuitum e M. paragordonae. Ao PCR 28,9% (37/128) e 25% (32/128) das amostras foram positivas, respectivamente para Francisella spp. e Mycobacterium spp. Na imunohistoquímica para Francisella spp. 48,4% (62/128) das amostras apresentaram marcações positivas, e para Mycobacterium spp., 61,7% (79/128). Ao avaliar as amostras por hibridização in situ para Francisella spp., 52,3% (67/128) das amostras apresentaram marcações positivas, e para Mycobacterium spp., 57% (73/128). Portanto, no presente estudo, foi possível verificar a presença dos agentes estudados pelas diversas técnicas empregadas, e ainda identificar a coinfecção entre Francisella spp. e Mycobacterium spp., ressaltando a importância do rastreamento de agentes causadores de doenças granulomatosas, que acarretam perdas econômicas, além de apresentar um alto potencial zoonótico.