El virus del mosaico del pepino (CMV) es un agente limitante en la producción y calidad de cultivos agrícolas; cuya inoculación efectiva y diagnóstico confiable son esenciales para implementar estrategias de manejo adecuadas y oportunas. Se evaluaron dos protocolos para la inoculación del CMV en plantas indicadoras (Nicotiana benthamiana y N. tabacum cv. Xanthi) y diferentes métodos de detección de este virus. La infección de plantas con CMV se logró mediante transmisión mecánica e infiltración. La presencia del virus se confirmó mediante la expresión de síntomas, serología (ImmunoStrip®), RT-PCR y por secuenciación. Los resultados confirmaron la efectividad del método de transmisión mecánica, en el cual, las plantas infectadas presentaron sintomatología asociada con el virus 15 días después de su inoculación. La prueba serológica permitió detectar la presencia del patógeno solo en las plantas de N. benthamiana, mientras que la prueba de RT-PCR en todas las plantas evaluadas. Los resultados de secuenciación mostraron altos valores de identidad nucleotídica con las secuencias reportadas en el NCBI para este virus. La transmisión mecánica fue el método más efectivo para la inoculación del CMV y las técnicas de análisis molecular fueron más sensibles y confiables para su identificación, en comparación con la prueba serológica.