Flow Cytometric Assessment of Viability of Lactic Acid Bacteria

Abstract

The viability of lactic acid bacteria is crucial for their applications as dairy starters and as probiotics. We investigated the usefulness of flow cytometry (FCM) for viability assessment of lactic acid bacteria. The esterase substrate carboxyfluorescein diacetate (cFDA) and the dye exclusion DNA binding probes propidium iodide (PI) and TOTO-1 were tested for live/dead discrimination using a Lactococcus, a Streptococcus, three Lactobacillus, two Leuconostoc, an Enterococcus, and a Pediococcus species. Plate count experiments were performed to validate the results of the FCM assays. The results showed that cFDA was an accurate stain for live cells; in exponential-phase cultures almost all cells were labeled, while 70°C heat-killed cultures were left unstained. PI did not give clear live/dead discrimination for some of the species. TOTO-1, on the other hand, gave clear discrimination between live and dead cells. The combination of cFDA and TOTO-1 gave the best results. Well-separated subpopulations of live and dead cells could be detected with FCM. Cell sorting of the subpopulations and subsequent plating on agar medium provided direct evidence that cFDA labels the culturable subpopulation and that TOTO-1 labels the nonculturable subpopulation. Applied to cultures exposed to deconjugated bile salts or to acid, cFDA and TOTO-1 proved to be accurate indicators of culturability. Our experiments with lactic acid bacteria demonstrated that the combination of cFDA and TOTO-1 makes an excellent live/dead assay with versatile applications.

Responses of Lactic Acid Bacteria to Stress – VBNC State

“…Popyt na te produkty związany jest głównie ze zmianą stylu życia społeczeństwa preferującego połączenie aspektu terapeutycznego oraz wygody. Z tego względu bakterie fermentacji mlekowej muszą spełniać wymagania dotyczące takich cech, jak: zdolność kolonizacji w przewodzie pokarmowym, zdolność przeżywania w środowisku o niskim pH oraz wysokim stęże-niu soli żółci, dobra przeżywalność w trakcie procesów technologicznych oraz podczas przechowywania, antagonizm w stosunku do drobnoustrojów chorobotwórczych, udokumentowane właściwości prozdrowotne [3,4]. Bakterie potencjalnie probiotyczne powinny być kontrolowane ze względu na bezpieczeństwo ich stosowania, w tym celu określa się m.in.…”

“…Jednym z ważniejszych kryteriów jest oporność szczepów na kwas żołądkowy i żółć, która determinuje zdolność utrzymania żywotności w przewodzie pokarmowym na poziomie pozwalającym wykazywać korzystny wpływ na organizm gospodarza [4]. Pierwszą barierą, jaką bakterie probiotyczne powinny pokonać, jest niskie pH żołądka, spowodowane wydzielaniem przez komórki gruczołowe błony śluzowej kwasu solnego.…”

“…Skoniugowane sole żółci, które są wydzielane do dwunastnicy, mogą podlegać dekoniugacji z udziałem hydrolazy soli żółci -BSH (ang. bile salts hydrolase) przez drobnoustroje zasiedlające jelita [4]. BSH katalizuje hydrolizę sprzężonych z tauryną lub glicyną soli żółci do wolnych kwasów żółciowych i aminokwasów, obniżając ich zdolności emulgujące [30].…”

“…Aktywność BSH szczepów nie przesądza jednoznacznie o formie zachowania się komórek poddawanych stresowi soli żółci. Wyniki badań wskazują, że wolne kwasy żółciowe uwalniane przez BSH są dużo bardziej toksyczne niż ich formy skoniugowane i wykazują efekt inaktywujący komórki bakteryjne przy stężeniu 0,5 % i niższym [4]. Wobec tego szczepy LAB mogą wykazywać wrażliwość w środowisku żółci, mimo wykazywania aktywności BSH.…”

“…[4] zbadali oporność szczepów LAB (Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus helveticus) na zmiany pH i zdekoniugowane sole żółci. Wykazano, że małe stężenie soli żółci (0,05 %) nie wpłynęło na przeżywalność badanych szczepów bakterii fermentacji mlekowej.…”