Genome-wide mapping of human DNA-replication origins: Levels of transcription at ORC1 sites regulate origin selection and replication timing

Abstract

We report the genome-wide mapping of ORC1 binding sites in mammals, by chromatin immunoprecipitation and parallel sequencing (ChIP-seq). ORC1 binding sites in HeLa cells were validated as active DNA replication origins (ORIs) using Repli-seq, a method that allows identification of ORI-containing regions by parallel sequencing of temporally ordered replicating DNA. ORC1 sites were universally associated with transcription start sites (TSSs) of coding or noncoding RNAs (ncRNAs). Transcription levels at the ORC1 sites directly correlated with replication timing, suggesting the existence of two classes of ORIs: those associated with moderate/high transcription levels ($1 RNA copy/cell), firing in early S and mapping to the TSSs of coding RNAs; and those associated with low transcription levels (<1 RNA copy/cell), firing throughout the entire S and mapping to TSSs of ncRNAs. These findings are compatible with a scenario whereby TSS expression levels influence the efficiency of ORC1 recruitment at G 1 and the probability of firing during S.[Supplemental material is available for this article.] DNA replication is a highly orchestrated process that ensures fidelity of genomes during duplications, as well as their adaptation to variations in cell division, DNA damage, and, in metazoa, chromatin changes associated with development and differentiation. It initiates from multiple chromosomal loci, called replication origins (ORIs), which are selected in the G 1 phase of the cell cycle by sequential recruitment of the origin recognition complex (ORC), CDC6, CDT1, and the MCM complex (the pre-replicative complex; pre-RC). Selected pre-RCs are then sequentially activated during the S phase, following a tight temporally ordered program (Mechali 2010).In Saccharomyces cerevisiae, ORIs contain a 12-bp consensus for ORC binding (Bell and Stillman 1992). Genome-wide analyses of ORIs by chromatin immunoprecipitation and parallel sequencing (ChIP-seq) using anti-ORC or -MCM antibodies showed that this consensus is essential but not sufficient for origin activity and identified other features that influence selection and replication timing, including transcription and/or chromatin structure (Eaton et al. 2010). In metazoa, instead, pre-RC does not exhibit sequence specificity, and the number of potential ORIs is considerably larger, following a process of selection that differs according to cell type, functional status, or stress conditions (Mechali 2010).These further levels of complexity allow DNA replication to adapt to the unique expression patterns of individual cell types. Little is known, however, about the regulation of ORI selection and replication timing in metazoa.

Comment l’approche génomique aide à comprendre le processus d’initiation de la réplication

“…Il est ainsi possible de purifier les bulles de réplication qui se forment aux origines, lors de l'initiation de la réplication, de purifier les segments d'ADN nouvellement synthétisés dans la bulle (SNS), de purifier les fragments d'Okazaki [41] (➜), ou de purifier les séquences ADN liées par le complexe ORC (Figure 1). Couplées à un séquençage en masse et une analyse informatique, ces approches permettent d'identifier les zones d'initiation de la réplication et de liaison du facteur ORC dans le génome humain, dans différents types cellulaires et en réponse à différentes conditions environnementales [4][5][6][7][8][9][10]. Chez l'homme, l'ensemble des études indique que les origines de répli-cation se présentent sous forme de zones, de quelques kilobases, bien définies sur le génome.…”

“…Ainsi, l'initiation de la réplication se produit dans des régions (ou zones) particulières et de manière bidirectionnelle. Les origines de réplication sont souvent associées à des éléments régulateurs de la transcription, comme les promoteurs et les séquences cis-régulatrices, suggérant que les mécanismes impliqués dans la régulation de la transcription pourraient également s'appliquer à la régulation de l'initiation de la réplication [4][5][6][7][8][9][10]. Une analyse plus approfondie des données démontre, toutefois, que les mécanismes de recrutement du complexe ORC et d'initiation de la réplication diffèrent d'une espèce à l'autre [3].…”

“…Chez les eucaryotes, l'étape initiale consiste en l'assemblage du complexe de pré-réplication (pré-RC) au cours de la phase G1 du cycle cellulaire. Ce complexe est formé par l'assemblage successif du complexe ORC1-6 (origin recognition complex [1][2][3][4][5][6], des protéines CDC6 (cell division cycle 6) et CDT1 (chromatin licensing and DNA replication factor 1), et finalement de deux complexes MCM2-7 (mini-chromosome maintenance 2-7) [1]. À l'entrée en phase S, l'activation des kinases CDK2 (cyclin dependent kinase 2) et CDC7 (cell division cycle 7-related protein kinase) conduit au recrutement des facteurs d'initiation de la réplication et à la duplication de l'ADN [1,2].…”

“…Pourtant aucun motif ADN ne reflète, de manière globale, la distribution de ces origines, suggérant que des facteurs de la chromatine ou de la transcription puissent être impliqués. Il existe ainsi une concordance entre sites d'initiation de la réplication et séquences cis-régulatrices de la transcription, notamment les sites promoteurs des gènes [4][5][6][7][8][9][10]. En effet, près de 30 % des sites d'initiation de réplication et des sites ORC sont retrouvés à proximité de promoteurs ( Figure 3A) ou de séquences cis-régulatrices de gènes ( Figure 3B).…”

“…Une caractéristique commune aux promoteurs, aux régions cis-régulatrices et aux sites d'initiation de la réplication, est la structure chromatinienne retrouvée dans ces régions. Celle-ci est souvent ouverte, les séquences ADN sont donc accessibles et de nombreux facteurs de transcription y sont liés ( Figure 3C) [4][5][6][7][8][9][10]16]. Bien qu'aucun ne soit détecté au niveau de l'ensemble des origines de réplication prédites, les facteurs de transcription pourraient cependant jouer un rôle clé dans l'initiation de la réplication.…”