Depot Air Minum Isi Ulang (DAMIU) merupakan salah satu kegiatan usaha yang semakin banyak jumlahnya dari tahun ke tahun termauk di Wilayah Kerja Puskesmas Layang Kota Makassar. Harga yang terjangkau, lebih praktis dan mudah diperoleh membuat banyak masyarakat yang mengkonsumsinya. Depot air minum tersebut harus memenuhi persyaratan hygiene sanitasi berdasarkan Permenkes Nomor 43 Tahun 2014. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui hubungan pelaksanaan hygiene sanitasi depot dengan kandungan bakteriologis air minum di wilayah kerja Puskesmas Layang Kota Makassar. penelitian ini bersifat deskriptif dengan menggunakan metode pendekatan Cross Sectional. Tekhnik pengambilan sampel adalah dengan total sampling yaitu mengambil seluruh populasi untuk dijadikan sampel sehingga sampel pada penelitian ini sebanyak 32 depot air minum. Pengumpulan data dilakukan dengan melakukan observasi, wawancara dan pengambilan sampel air minum yang diperiksa di Laboratorium Dinas Kesehatan Kota Makassar. Hasil penelitian dianalisis secara univariat dan bivariat dengan uji statistik menggunakan uji chi square. Hasil penelitian menunjukkan adanya hubungan antara tempat pengolahan dengan kandungan bakteriologis air minum yaitu (p = 0,039 lebih kecil α = 0.05), ada hubungan antara peralatan pengolahan dengan kandungan bakteriologis air minum yaitu (p = 0,011 lebih kecil α = 0.05). Tidak ada hubungan antara penjamah dengan kandungan bakteriologis air minum dengan (p = 0,423 lebih besar α= 0.05). Disarankan kepada pemilik depot air minum yang ada di wilayah kerja Puskesmas Layang agar memperhatikan kondisi tempat, peralatan, dan kesehatan penjamah/pengelola depot air minum untuk menghasilkan kualitas air minum yang memenuhi syarat.