Uji sitotoksisitas merupakan tes skrining, yang digunakan untuk evaluasi reaksi sel hidup terhadap implan dalam tes kultur sel. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui kemampuan sitotoksik akar kedayan terhadap sel telur Tripneustes gratilla terfertilisasi. Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan membandingkan kemampuan penghambatan pembelahan embrio Tripneustes gratilla antara kelompok kontrol negatif, konsentrasi 10, 100, dan 1000 bpj, kemudian dilakukan pengamatan pembelahan sel embrio pada jam ke 1, 2, 4, dan 12 sejak fertilisasi. Setelah pembuahan, analisis statistik komparatif dilakukan dengan menggunakan uji ANOVA, dilanjutkan dengan Uji Post Hoc Tukey HSD. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kontrol negatif dan konsentrasi 10 ppm tidak menghambat pembelahan sel telur Tripneustes gratilla yang telah dibuahi (p-value >0,05), sedangkan ekstrak etanol 100 dan 1000 ppm secara signifikan menghambat pembelahan sel telur Tripneustes gratilla (p-value <0,05). Penelitian ini menyimpulkan bahwa ekstrak etanol akar kedayan memiliki kemampuan sitotoksik dengan menghambat perkembangan telur fertil Tripneustes gratilla dengan kisaran dosis sitotoksik optimum pada konsentrasi 10-100 ppm. Hasil penelitian menunjukkan hanya kelompok konsentrasi 100 ppm dan 1000 ppm memiliki kemampuan sitotoksik dibandingkan kontrol negatif (p-value <0,05), dan konsentrasi optimum aktivitas sitotoksik berada pada 10-100 bpj.