In vitro μελέτη της ελάχιστης συγκεντρώσεως που αναστέλλει τις μεταλλάξεις (mutant prevention concentration, MPC) και των μηχανισμών αντοχής στελεχών pseudomonas aeruginosa έναντι των καρβαπενεμών

Abstract

ΣκοπόςΣκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη προσδιορισμού της ελάχιστης συγκέντρωσης του αντιβιοτικού, που προλαμβάνει την εμφάνιση κάθε μεταλλαγμένου μικροβιακού στελέχους (Μutant Prevention Concentration, MPC) σε κλινικά στελέχη Pseudomonas aeruginosa, που υποβάλλονται in vitro σε σταδιακά αυξανόμενες συγκεντρώσεις ιμιπενέμης / σιλαστατίνης. Επιπρόσθετο στόχο αποτελεί η εξακρίβωση των μηχανισμών αντοχής του μικροβίου, που επάγονται από το αντιβιοτικό στις ιδιαίτερες συνθήκες του πειράματος.Υλικά και Μέθοδοι Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 16 ευαίσθητα στην ιμιπενέμη/σιλαστατίνη κλινικά στελέχη P.aeruginosa. Η τυποποίηση των βακτηριακών στελεχών έγινε με το σύστημα ΑΡΙ ID32GN και ID32E. Η μελέτη της ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο διάχυσης σε δίσκο σε άγαρ Mueller- Hinton, τη μέθοδο συνέργειας διπλού δίσκου (DDST) και τη μέθοδο συνέργειας δίσκων αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέως (EDTA)-Iμιπενέμης. Ο προσδιορισμός της MPC έγινε με επίστρωση 1010 κυττάρων από κάθε αρχικό μικροβιακό στέλεχος σε σειρά τρυβλίων με άγαρ ΜcConkey, που περιείχαν διαφορετικές συγκεντρώσεις ιμιπενέμης (1XMIC - 32mg/L). Ως MPC κατεγράφετο η συγκέντρωση εκείνη της ιμιπενέμης, στην οποία δεν υπήρχε καμμία ανάπτυξη του στελέχους. Μετρήθηκε η MIC, με την μέθοδο αραίωσης σε άγαρ, των αποικιών (τελικών στελεχών) που αναπτύσσονταν στην μεγαλύτερη συγκέντρωση ιμιπενέμης (δηλαδή στην αμέσως μικρότερη συγκέντρωση πριν την MPC). Η μέτρηση των MIC έγινε και με ταυτόχρονη χρήση δύο αναστολέων των αντλιών ενεργητικής αποβολής CCCP και PAβN. Η επιδημιολογική τυποποίηση των στελεχών έγινε με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε εναλλασσόμενο πεδίο ολικού DNA (PFGE). Η μέθοδος PCR με τη χρήση κατάλληλων εκκινητών, χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των γονιδίων των β-λακταμασών, καθώς και για την αλληλούχιση του γονιδίου oprD. Για την ποσοτική μελέτη της έκφρασης των γονιδίων oprD, mexB, mexY, mexD και ampC χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (QRT-PCR).ΑποτελέσματαΗ πλειονότητα των στελεχών ήταν ευαίσθητα σε όλες τις κατηγορίες αντιψευδομοναδικών αντιβιοτικών και όλα ήταν αρνητικά στη δοκιμασία ανίχνευσης παραγωγής MBL. Η επιδημιολογική τυποποίηση με PFGE κατέδειξε διαφορετικούς κλώνους. Η διακύμανση των MIC στην ιμιπενέμη ήταν 0,5-2 μg/ml και στη μεροπενέμη 0,25-4 μg/ml.Οι τιμές της MPC της ιμιπενέμης ήταν 4-32 μg/ml (το 75 % είχε τιμές ≥ 16 μg/ml). Το πηλίκο MPC/MIC των στελεχών αυτών ήταν από 4 έως 32 (το 70 % είχε τιμές 8 και 16). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στις ΜΙC των αντιβιοτικών που ελέγχθηκαν παρουσία καθενός από τους αναστολείς αντλιών ενεργητικής αποβολής (εκροής). Σε κανένα τελικό στέλεχος δεν παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της έκφρασης του oprD (≤ 30 %) σε σχέση με το αντίστοιχο αρχικό κλινικό του στέλεχος. Δύο στελέχη παρουσίασαν σημαντική αύξηση (≥ x10) και άλλα 4 οριακή αύξηση στην παραγωγή του ampC. Ένα στέλεχος παρουσίασε αυξημένη έκφραση όλων των αντλιών εκροής και οριακή αύξηση της έκφρασης του ampC, ενώ ένα άλλο παρουσίασε αυξημένη έκφραση μόνον της αντλίας εκροής mexY και οριακή αύξηση της έκφρασης του ampC. Ο γονιδιακός έλεγχος του oprD στα τελικά στελέχη απεκάλυψε την αμινοξική αλλαγή S278P, που οδηγεί σε αλλαγή διαμόρφωσης βρόγχου της ΟprD και σε αύξηση της αντοχής. Επίσης ανευρέθησαν 2 νουκλεοτιδικές αλλαγές στα nt 360 και nt 831, 3 ελλείψεις νουκλεοτιδίων στις θέσεις 541, 688 και 784 , μία έλλειψη ενός τμήματος νουκλεοτιδίων 85 bp στις θέσεις 1131-1215 και μία εισδοχή στη θέση 1060 ενός τμήματος νουκλεοτιδίων 1000 bp με χαρακτήρες μεταθετού στοιχείου (transposon). Oι αλλαγές αυτές οδηγούν στη δημιουργία μίας μικρότερης και μη λειτουργικής πρωτεΐνης OprD και επίσης σε αύξηση της αντοχής των τελικών στελεχών στις καρβαπενέμες. ΣυμπεράσματαΗ εφαρμογή της MPC μπορεί να αποτελέσει μία χρήσιμη μέθοδο ανάδειξης ανθεκτικών στελεχών, μετά από έκθεσή τους σε διάφορες συγκεντρώσεις αντιβιοτικού υπό συνθήκες υψηλού ενοφθαλμίσματος. Η συστηματική διερεύνηση των μηχανισμών αντοχής των στελεχών αυτών μπορεί να βοηθήσει στην βαθύτερη κατανόηση της δράσης των αντιβιοτικών και στην ανάπτυξη νέων πιο ισχυρών αντιμικροβιακών ουσιών.