Industrial Large Scale of Suspension Culture of Insect Cells

Bone Marrow Tyrosine kinase in the chromosome X (BMX) is a TEC family kinase associated with numerous pathological pathways in cancer cells. Covalent inhibition of BMX activity holds promise as a therapeutic approach against cancer. To screen for potent and selective covalent BMX inhibitors, large quantities of highly pure BMX are normally required which is not a simple task with the currently available production and purification processes. Here, we developed a scalable production process for the human recombinant BMX (hrBMX) using the insect cells-baculovirus expression system.Comparable expression levels were obtained in small-scale shake flaks (13 mL) and in stirred-tank bioreactors (STB, 5 L). A 2-step chromatographic-based process was implemented, reducing purification times by 75 % when compared to traditional processes, while maintaining hrBMX stability. The final production yield was 24 mg of purified hrBMX per litter of cell culture, with a purity of >99%. Product quality was assessed and confirmed through a series of biochemical and biophysical assays, including circular dichroism and dynamic light scattering. Overall, the platform herein developed was capable of generating 100 mg purified hrBMX from 5 L STB in just 34 days, thus having potential to assist in-vitro covalent ligand high-throughput screening for BMX activity inhibition.

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“…1, F). IC-BEVS is being used in industrial settings for the production of several recombinant proteins [25],…”

Section: Production and Purification Of Hrbmxmentioning

confidence: 99%

A scalable insect cell-based production process of the human recombinant BMX for in-vitro covalent ligand high-throughput screening

Sousa

Marques

et al. 2020

Bioprocess Biosyst Eng

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“…Several reactor systems with low shear stress and high rates of oxygen and carbon dioxide transfer have been designed or adapted for the BEVS, including the rotating wall reactor [25] and the wave reactor [26]. However, most processes still use a stirred-tank reactor (STR) due to the simpler process control and scalability [27,28].…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

The components of shear stress affecting insect cells used with the baculovirus expression vector system

Weidner

Druzinec

Mühlmann

et al. 2017

Zeitschrift Für Naturforschung C

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Insect-based expression platforms such as the baculovirus expression vector system (BEVS) are widely used for the laboratory-and industrial-scale production of recombinant proteins. Thereby, major drawbacks to gain high-quality proteins are the lytic infection cycle and the shear sensitivity of infected insect cells due to turbulence and aeration. Smaller bubbles were formerly assumed to be more harmful than larger ones, but we found that cell damage is also dependent on the concentration of protective agents such as Pluronic ® . At the appropriate concentration, Pluronic forms a layer around air bubbles and hinders the attachment of cells, thus limiting the damage. In this context, we used microaeration to vary bubble sizes and confirmed that size is not the most important factor, but the total gas surface area in the reactor is. If the surface area exceeds a certain threshold, the concentration of Pluronic is no longer sufficient for cell protection. To investigate the significance of shear forces, a second study was carried out in which infected insect cells were cultivated in a hollow fiber module to protect them from shear forces. Both model studies revealed important aspects of the design and scale-up of BEVS processes for the production of recombinant proteins.

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“…Assim, é possível prever o tempo ideal de coleta, mesmo com baixos MOIs, e definir com precisão a janela de tempo ideal para realizar tais operações, minimizando as perdas de produto.Nosso trabalho realizou a coexpressãao das proteínas RVM e RVGP, e os dados da literatura corroboraram com os resultados obtidos no ensaio de cinética (Figura 23), no qual a detecção das proteínas RVM e RVGP apresentaram melhor sinal no MOI 0,1 e coleta após 96 h.p.i. Depois disso, a detecção das proteínas diminuiu com o MOI mais alto e com tempo superior a 96 h. Com o aumento da morte celular após a infecção, a degradação das proteínas é aumentada(ROLDÃO et al, 2014), tal fato pode ocorrer por conta das proteases celulares que poderiam degradar as VLPs.Vale ressaltar, que nossos experimentos foram realizados em pequena escala (frascos Schotts com 20 mL de volume de trabalho) e que possivelmente esses dados terão que ser adaptados para utilização em um sistema de larga escala.Nossos dados também demostraram a expressão de ambas as proteínas do vírus independentemente. Tanto a RVM quanto a RVGP se apresentaram nos tamanhos conformacionais esperados, 25 kDa e 55 kDa, respectivamente.…”

unclassified

“…O MOI ideal é dependente do produto alvo (expressão de proteína única ou múltipla, secretada ou não secretada), da estratégia de produção (única ou coinfecção) e do título viral.Para a expressão múltipla de proteínas, a automontagem de complexos proteicos é altamente correlacionada com a estratégia de produção; assim, várias combinações de MOI podem maximizar a formação de produtos(ROLDÃO et al, 2014).galactosidase observada para valores de MOI superiores a 1 em culturas infectadas precocemente é o resultado da infecção síncrona de massa. Assim, o número total de células infectadas com A…”

unclassified

Expressão da glicoproteína G (RVGP) e proteína de matriz (M) do vírus da raiva utilizando baculovírus recombinante

Bernardino

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Bernardino, que muitas vezes se doaram e renunciaram aos seus sonhos, para que eu pudesse realizar os meus. Vocês são meu exemplo de força e dedicação, sem seus ensinamentos e cuidados eu nada teria conseguido. Sim, nós conseguimos! Agradeço pela paciência e compreensão com minha ausência durante essa longa jornada. Obrigada! AGRADECIMENTOSQuero agradecer à Deus e a todos os anjos pelos caminhos que me proporcionaram ao longo da minha vida, pelas conquistas, pelos tropeços que me fizeram mais fortes e por me darem força interior para seguir em frente.Aos meus pais, Maria Antônia Consoni Bernardino e Paulo David Bernardino pela paciência, pelo amor incondicional, carinho, respeito, incentivo e suporte. Por me ensinarem que é necessário batalhar e correr atrás dos nossos sonhos, sem esses valores e educação eu nada seria.À minha irmã, Leticia Consoni Bernardino, pelo companheirismo, respeito e incentivo.À minha cachorra, Vida por tornar meus dias mais leves e alegres. Sem dúvida anjo da guarda tem quatros patas.Ao meu marido, Odirlei Araújo de Aguiar, pelo companheirismo, respeito, incentivo, suporte e paciência.À minha, não somente Orientadora, mas muito mais do que isso, uma grande amiga Dra.Soraia Attie Calil Jorge. Tive a sorte e o privilégio de ser sua aluna no Mestrado e no Doutorado, poucos tiveram essa oportunidade e serei sempre grata. Obrigada por todos os ensinamentos na pesquisa científica, por sempre auxiliar e me conduzir nessa difícil, porém encantadora área."A escolha de um jovem depende da sua inclinação, mas também da chance de conhecer um grande mestre" -Rita Levi Montalcini.Ao Dr. Renato Mancini Astray que sempre se mostrou disposto a me auxiliar quando tive dúvidas, por toda a sua paciência e ensinamentos. Ao Dr. Carlos Augusto Pereira (in memorian) pela oportunidade de poder desenvolver esse projeto. Infelizmente o senhor partiu antes de eu concluir, mas tenho certeza que onde o senhor estiver, estará muito orgulhoso de nós! Obrigada pela oportunidade.À minha grande amiga Sandra Fernanda Súarez Patiño, eu não tenho palavras para te agradecer, mesmo distante sempre esteve presente! Agradeço por todos os ensinamentos, carinho e por não me deixar desanimar e desacreditar. "Aqueles que passam por nós, não vão sós, não nos deixam sós. Deixam um pouco de si, levam um pouco de nós" -Antoine de Saint-Exupery.Agradeço a todos, sem exceções, do laboratório de Imunologia Viral do Instituto Butantan. Todos esses anos, quase 12 anos, foram fundamentais para o meu crescimento emocional, profissional e pessoal. Muito obrigada pelo carinho, risadas e conselhos.Aos amigos do Laboratório de Biologia Celular do Instituto Butantan, em especial à Simone Gonçalves Silva Jared, agradeço a ajuda, carinho e torcida.Ao Professor Bergmann Ribeiro, pela oportunidade de realizar um pequeno estágio em seu laboratório na Universidade de Brasília. Esse estágio me proporcionou um grande aprendizado para o desenvolvimento do meu projeto.À Lorena Chaves por me ensinar pacientemente, pela ajuda sempre que necessária, pelo carinh...

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Industrial Large Scale of Suspension Culture of Insect Cells

Cited by 8 publications

References 180 publications

A scalable insect cell-based production process of the human recombinant BMX for in-vitro covalent ligand high-throughput screening

A scalable insect cell-based production process of the human recombinant BMX for in-vitro covalent ligand high-throughput screening

The components of shear stress affecting insect cells used with the baculovirus expression vector system

Expressão da glicoproteína G (RVGP) e proteína de matriz (M) do vírus da raiva utilizando baculovírus recombinante

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