Pasak bumi (Eurycoma longifolia Jack) adalah salah satu tanaman herbal dari negara-negara Asia Tenggara yaitu Indonesia, Malaysia, dan Vietnam. Bagian tanaman yang memiliki khasiat adalah bagian daun, akar dan batang. Berbagai macam senyawa kimia telah diisolasi dan dikarakterisasi dari Eurycoma longifolia, serta diketahui memiliki berbagai efek yang menguntungkan seperti male fertility enhancement effect, antimalarial effect, cytotoxic and anti-proliferative effect, antimicrobial effects, anti-inflammatory effects, anti-anxiolytic, anti diabetic, osteoporosis preventive effect, ameliorative effect, ergoganic effect, insecticidal effects, muscular effect, antiulcer effect dan anti-rheumatism effect. Tanaman ini sangat potensial untuk digunakan dalam produk farmasi herbal. Komposisi senyawa kimia dari tumbuhan adalah esensial untuk penentuan kualitas, keamanan dan efektifitas dari produk herbal. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kandungan eurycomanone pada ekstrak akar pasak bumi, serta mengetahui pelarut terbaik dalam proses ekstraksi dari akar pasak bumi yang menghasilkan kadar eurycomanone tertinggi. Metode pembuatan ekstrak dengan cara melakukan maserasi simplisia akar pasak bumi menggunakan pelarut etanol 30%, etanol 70%, etanol 96%, n-heksana, etilsetat dan air. Tahap awal penelitian dimulai dengan melakukan uji fitokimia dan uji kadar air pada simplisa. Selanjutnya pada masing-masing ekstrak dilakukan uji toksisitas terhadap larva udang serta penentuan kadar eurycomanone dengan High-performance liquid chromatography (HPLC). Hasil rendemen ekstrak pasak bumi tertinggi terdapat pada ekstrak dengan menggunakan pelarut etanol 70% sebesar 3.41 g. Hasil pengujian fitokimia simplisia pasak bumi mengandung flavonoid dan saponin. Toksisitas tertinggi terdapat pada ekstrak dengan menggunakan pelarut etilasetat dengan nilai LC50 sebesar 201.28 ppm. Ekstrak pasak bumi dengan pelarut etanol 70% memiliki kadar eurycomanone tertinggi yaitu 53.42 mg/g.