Kettenterminierende und durch Click‐Chemie modifizierbare NAD⁺‐Analoga zur Markierung von Zielproteinen der ADP‐Ribosyltransferasen

Abstract

ADP-Ribosyltransferasen (ARTs) nutzen NAD + als Substrat und spielen aufgrund der Übertragung von mehreren ADP-Ribose-Einheiten sowie der Bildung von Poly(ADP-Ribose)(PAR)-Ketten unterschiedlicher Länge an Zielproteinen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen wie der DNA-Schadensantwort und der Zellzyklusregulierung. Bestrebungen, die Zielproteine der PARylierung sowie deren spezifischen ADP-Ribose-Akzeptorstellen zu identifizieren, müssen die Komplexität der PAR überwinden. Wir berichten hier von neuen NAD + -Analoga, die effizient durch Wildtyp-ARTs verarbeitet werden und infolge der Abwesenheit bençtigter Hydroxygruppen zum Kettenabbruch führen, was zu einer Verringerung der Komplexität dieser Proteinmodifikation führt. Die Anwesenheit einer Alkingruppe in den hier vorgestellten NAD + -Analoga ermçglicht die anschließende Markierung mit Farbstoffen oder Affinitätsmarkern mittels Click-Chemie. Diese Studie bietet Einsicht in das ART-Substratspektrum und kçnnte den Weg für weitere Entwicklungen chemischer Werkzeuge zur Erforschung des PAR-Metabolismus bereiten.

Emissive Synthetic Cofactors: A Highly Responsive NAD+Analogue Reveals Biomolecular Recognition Features

“…To facilitatea dequate detection and differentiation between modified and unmodifiedP ARP1, western blottingb ased on anti-PARP1 and anti-pADPr antibodies was performed. [21] Initial attempts to spectroscopically monitor this transformation in real time did not reveala ny change in emission intensity,n either upon treatment with N tz AD + + nor with N th AD + + .T he Coomassie-stained SDS-PAGE (Figure 5a)d id show, however, PARP1-related bands to decrease in intensity over time for both cofactors. This decrease is most striking upon adding NAD + + and still substantial upon N tz AD + + treatment, whereas addition of N th AD + + shows only little effect.…”

“…[13][14][15][16][17] Given that PARP1 can act as both the enzyme and the target, we studied its auto-poly(ADP-ribosyl)ation using all cofactors and calf thymus DNA as the activating agent. [21,53,54] Ac-cordingly, as olution of PARP1 was treated with calf thymus DNA beforeinducing the reaction with N tz AD + + or N th AD + + .Positive controls included native NAD + + and negative controlsi ncluded reaction mixtures without the cofactors. The conversion was then monitored at different time points both spectroscopically and by sodiumd odecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).…”

“…[13][14][15][16][17][18] The significance of NAD + + -mediated processesn ecessitatest he development of new tools and probest of acilitate biophysical analyses and the fabrication of effective discoverya ssays. Radioactive, [19] clickable, [20,21] isotopically labeled, [22] and fluorescent [23,24] NAD + + surrogates have been developed. Designo ft he latter has employed the incorporation of emissive adenosine analogues, including the perturbing 1,N 6 -ethenoadenosine and 8-(pyrrol-2yl)adenosine.…”