La protéomique quantitative par la méthode SILAC

Abstract

La protéomique quantitative GénéralitésLe domaine de la protéomique -définie comme l'étude de l'ensemble des protéines d'un échantillon biologique donné -s'est développé de façon spectaculaire au cours des dernières années [1,2]. Les progrès majeurs réalisés dans le domaine de l'instrumentation pour la protéomi-que (spectrométrie de masse, chromatographie liquide nano-débit), associés à la masse d'informations sans cesse croissante disponible dans les banques de données et à la conception de nouveaux outils logiciels, ont conduit à la mise en place de stratégies qui permettent d'analyser le protéome des échantillons biologiques de manière efficace et fiable. Ainsi, des inventaires de protéines de plus en plus complets ont pu être établis dans le cadre de travaux menés chez l'homme et chez des organismes modèles. Indéniablement, ces inventaires réalisés à partir d'échantillons plus ou moins complexes et ciblés (tissus, cellules, compartiments subcellulaires, complexes protéiques, etc.) ont participé à une meilleure connaissance des acteurs moléculaires impliqués dans les grands « mécanismes du vivant ». Le principe général d'une analyse protéomique est pré-senté dans la Figure 1 et > Les approches de protéomique quantitative basées sur la spectrométrie de masse sont parfaitement adaptées à la détection de changements au niveau protéique entre échantillons biologiques. Parmi ces techniques, la méthode SILAC (stable isotope labelling by amino acids in cell culture) a démontré un réel potentiel. Cette méthode s'avère en effet être précise et relativement simple à mettre en oeuvre pour quantifier les protéines extraites de cellules en culture. Le principe est le suivant : les cellules sont cultivées dans un milieu contenant soit des acides aminés naturels (synthèse de protéines « légères »), soit leurs équivalents isotopiquement marqués (synthèse de protéines « lourdes »). Les populations cellulaires à comparer sont mélangées et traitées comme un seul échantillon, ce qui permet de préparer les protéines d'intérêt sans risquer d'introduire des erreurs de quantification. Au cours de l'analyse par spectrométrie de masse, l'abondance relative entre les échantillons biologiques peut être calculée pour chaque protéine en comparant l'intensité des peptides légers et lourds. Comme le montrent ses applications à diverses problématiques biologiques et cliniques, la méthode SILAC est particulièrement prometteuse pour l'élucidation des mécanismes moléculaires impliqués dans les grandes fonctions cellulaires, ainsi que pour l'identification de biomarqueurs de maladies. La limitation de la méthode SILAC à la quantification de protéines issues de cellules en culture vient d'être levée suite à la description d'une souris SILAC dont toutes les protéines sont marquées isotopiquement. Ces travaux laissent présager une extension de cette stratégie analytique à l'étude différentielle de tissus et de fluides biologiques d'animaux modèles. < Article disponible sur le site

Quantitative Proteomic Analysis of the Hfq-Regulon in Sinorhizobium meliloti 2011

“…Since its introduction in 2002 [22], the metabolic labelling strategy that uses stable isotopes in the growth medium has shown its potential for the determination of highly accurate quantitative proteomic profiles when coupled with high performance liquid chromatography and mass spectrometry [23], [24]. Still, this technical approach remains mostly unexplored in bacteria: only a few projects considered metabolic labelling with stable isotopes coupled with LC/MS [25], [26], [27] compared with the huge number of proteomic studies based on comparative 2D-PAGE profiles.…”

Analysein vivode la signalisation tumorale induite par les tyrosine-kinases par protéomique quantitative

“…Par exemple, ces anticorps ont permis d'identifier les premiers substrats de Src contrôlant l'adhésion à la matrice extracellulaire, tels que la cortactine, révélant ainsi un rôle important de cette enzyme dans ce processus cellulaire (Figure 1) [12]. Cependant, ces approches ne permettent pas d'identifier ni de quantifier les sites de phosphorylation, en particulier DOSSIER TECHNIQUE REVUES premier choix pour la réalisation d'analyses quantitatives robustes et reproductibles [15]. Son principe est basé sur le marquage métabolique du protéome cellulaire par incorporation d'acides aminés isotopiquement alourdis (non radioactifs) contenus dans le milieu de culture ( Figure 3A).…”

“…Dans ce contexte, la méthode SILAC ne semble pas appropriée pour réaliser de telles analyses à cause du marquage métabolique de la tumeur nécessaire à l'analyse protéomique quantitative. Toutefois, de nouvelles méthodes ont permis de contourner ce problème par l'addition d'acides aminés lourds dans l'environnement nutritionnel, permettant ainsi un marquage significatif de plusieurs organismes entiers, dont le poisson zèbre, le nématode, la drosophile, le triton et la souris [15,20]. Par exemple, l'addition de [ 13 C 6 ]-lysine lourde dans la nourriture des rongeurs permet le marquage protéique complet de tous les organes de souris après deux générations.…”

La chromatine naissante révélée

“…matine mature) (Figure 1) [12]. Pour cela, la méthode NCC a été combinée à la méthode SILAC (stable isotope labeled aminoacids in cell culture, [17]), ce qui permet de quantifier de façon relative et précise les protéines contenues dans les deux conditions par spectrométrie de masse. En parallèle, pour améliorer le ratio signal/bruit de fond pour la spectrométrie de masse, les conditions de lavage ont été mises au point afin d'être les plus stringentes possibles.…”