ABSTRACT. The present work aimed characterize isolates of C. lindemuthianum race 65 from different regions in Brazil by ITS sequencing. A total of 17 isolates of race 65, collected in the states of Mato Grosso, Minas Gerais, Paraná, Santa Catarina and São Paulo, were studied. Analysis of the sequences of isolates 8, 9, 12, 14 and 15 revealed the presence of two single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the ITS1 region at the same positions. These isolates, when analyzed together with the sequence of isolate 17, revealed a SNP in the ITS2 region. The highest genetic dissimilarity, observed between isolates 11 and 3 and between isolates 11 and 10, was 0.772. In turn, isolates 7 and 2 were the most similar, with a value of 0.002 for genetic distance. The phylogenetic tree obtained based on the sequences of the ITS1 and ITS2 regions revealed the formation of two groups, one with a subgroup. The results reveal high molecular variability among isolates of race 65 of C. lindemuthianum.Keywords: anthracnose, genetic variability, pathogens, dissimilarity.Caracterização da raça 65 de Colletotrichum lindemuthianum utilizando sequenciamento das regiões ITS RESUMO. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar isolados de C. lindemuthianum da raça 65 provenientes de diversas regiões do Brasil, por meio de sequenciamento de regiões ITS. Um total de 17 isolados da raça 65, coletados nos estados do Mato Grosso, Minas Gerais, Paraná, Santa Catarina e São Paulo, foram estudados. As análises das sequências dos isolados 8, 9, 12, 14 e 15 revelaram a presença de dois SNPs na região ITS1 nas mesmas posições. Estes mesmos isolados quando analisados juntamente com a sequência do isolado 17 apresentaram um SNP na região ITS2. A maior dissimilaridade genética foi de 0,772 observada entre os isolados 11 e 3 e entre os isolados 11 e 10. Por sua vez, os isolados 7 e 2 foram os mais similares, com valor de distância genética de 0,002. A árvore filogenética obtida com base nas sequências das regiões ITS1 e ITS2 revelou a formação de dois grupos, sendo um com a divisão de um subgrupo. Estes resultados revelam uma elevada variabilidade molecular entre isolados da raça 65 de C. lindemuthianum.