Obtaining Recombinant Nucleocapsid Protein of PPR Virus for Disease Serodiagnostic

Abstract

Чума мелких жвачных (ЧМЖ, peste des petits ruminants)-высококонтагиозная, остро или подостро протекающая вирусная болезнь овец и коз, характеризующаяся язвенными поражениями слизистой оболочки ротовой полости, лихорадкой, поражением лимфоидной системы, развитием пневмонии, геморрагическим гастроэнтеритом (A. Diallo с соавт., 1989; T.M. Ismail с соавт., 1995). Из-за высокой заболеваемости (50-100 %) и смертности (50-90 %) ЧМЖ относится к числу опасных заболеваний, наносящих значительный экономический ущерб (R.A. Kock с соавт., 2015). Возбудитель болезни-вирус ЧМЖ (род Morbillivirus, сем. Paramyxoviridae) антигенно связан с другими морбилливирусами (G. Libeau с соавт., 2014). Степень проявления клинических признаков заболевания зависит от линии вируса ЧМЖ, вида, породы, иммунного статуса животных. Поэтому окончательный диагноз должен быть подтвержден в лаборатории. Для диагностических и мониторинговых серологических исследований предпочтение отдается технологичному и чувствительному методу иммуноферментного анализа (ИФА). Современные средства серодиагностики ЧМЖ разрабатываются на основе вирусоспецифичных рекомбинантных белков, в первую очередь нуклеокапсидного (N) белка (M. Munir с соавт., 2013; Н.В. Вавилова с соавт., 2006.), который по антигенным и иммуногенным характеристикам превосходит остальные белки морбилливирусов (M. Yunus с соавт., 2012). Белок N-наиболее консервативный антиген из протеинов вируса ЧМЖ (M. Muhammad, 2013). Целью представленной работы было получение рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса чумы мелких жвачных для использования в качестве антигена и вирусоспецифичных антисывороток свиней как источника антител для серодиагностики заболевания методом конкурентного ИФА. Была получена конструкция, несущая последовательность фрагмента гена белка N длиной 1530 п.н. в составе экспрессирующего плазмидного вектора pET32a. Скрининг полипептидов методом SDS-PAGE и в иммуноблоттинге выявил клоны Escherichia coli pET32а/N/10, экспрессирующие вирусоспецифичный мажорный полипептид с молекулярной массой 70 кДа. Проведенные нами исследования показали, что оптимальная доза очищенного методом металлохелатной хроматографии рекомбинантного белка N в конкурентном ИФА составила 0,25 мкг на лунку. Соотношение результатов реакции с отрицательной и положительной контрольными сыворотками коз при OD 450 составило 11,52. Таким образом, очищенный электрофоретически и иммунохимически чистый рекомбинантный белок N пригоден для применения в конкурентном ИФА для серодиагностики ЧМЖ. Для получения специфичных антисывороток свиньям вводили очищенный вирус ЧМЖ. Титры антител в пробах антисывороток крови свиней в реакции нейтрализации (РН) с вирусом ЧМЖ составили 1:64-1:128. Эти значения были сопоставимы с титрами антител в сыворотках крови у вакцинированных против ЧМЖ овец и коз (А.В. Константинов с соавт., 2017). Однако при конкурентном ИФА антисыворотки свиней оказались менее эффективными по сравнению с положительной козьей сывороткой. Ключевые слова: чума мелких жвачных животных, морбивирусы, диагностика, рекомбинантны...