Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh tingkat pengetahuan peternak dan penerapan biosekuriti pada peternakan babi terhadap persentase mortalitas akibat virus African swine fever (ASF) di Kota Palangka Raya. Pada penelitian ini metode yang digunakan adalah survei dan observasi. Responden berjumlah 30 orang yang mempunyai peternakan babi di Kota Palangka Raya. Wawancara dilakukan dengan para peternak yang telah dipilih sebagai sampel, untuk memperoleh informasi dan penjelasan langsung mengenai tingkat pengetahuan biosekuriti. Tingkat penerapan biosekuriti diperoleh dengan cara observasi langsung di kandang babi. Hasil penelitian menunjukan adanya pengaruh nyata (p<0,05) pada parameter pendidikan terhadap pengetahuan biosekuriti, namun tidak ada pengaruh yang nyata (p>0,05) pada parameter usia dan jenis pekerjaan utama terhadap pengetahuan biosekuriti peternak. Peternak dikelompokkan dalam tiga katagori pengetahuan yaitu buruk (33,3%), sedang (26,7%), dan baik (40%). Tingkat penerapan biosekuriti peternak dibagi menjadi tiga yaitu buruk ada lima (16,6%), sedang 17 (56,7%) dan baik delapan (26,7%). Analisis dilanjutkan untuk melihat pengaruh pengetahuan dan penerapan sekuriti terhadap tingkat mortalitas babi yang disebabkan oleh ASF. Hasil penelitian menunjukan adanya pengaruh yang nyata antara pengetahuan dan penerapan biosekuriti (p<0,05) terhadap tingkat mortalitas babi yang disebabkan oleh ASF. Disimpulkan bahwa peternak babi di Kota Palangka Raya secara umum belum memiliki tingkat pengetahuan dan penerapan biosekuriti yang baik, sehingga perlu adanya peningkatan biosekuriti untuk menanggulangi ASF.