Polymerase chain reaction for the diagnosis of bovine genital campylobacteriosis

Abstract

RESUMO.-[Reação em cadeia da polimerase para o diagnóstico de campilobacteriose genital bovina.] Campilobacteriose genital bovina é uma doença venérea comum em bovinos. A prevalência desta doença pode ser subestimada na maioria das vezes pela natureza microaeróbica do agente etiológico, Campylobacter fetus subspecies venerealis. O propósito do presente estudo foi avaliar a utilização da reação de polimerase em cadeia (PCR) no diagnóstico de campilobacteriose genital em amostras obtidas de aspirado prepucial de touros, muco cervical de vacas e conteú-do abomasal de fetos abortados, coletados em meio enriquecido. Cinco protocolos diferentes de extração de DNA foram testados: termo extração, lise com proteinase K, lise com guanidine isothiocyanate, lise com DNAzol e lise com hexadeciltrimetilamônio brometo (CTAB). A especificidade, sensibilidade e a aplicação da técnica da PCR foram também avaliadas com amostras clínicas e comparadas com bactérias isoladas por cultura padrão. DNA extraído pelo protocolo de CTAB demonstrou os melhores resultados na PCR, e foi capaz de detectar 63 unidades formadoras de colônias de C. fetus por ml de meio. Bovine genital campylobacteriosis is a common venereal disease of cattle; the prevalence of this disease can be underestimated mostly because of the nature of the etiological agent, the microaerobic Campylobacter fetus subspecies venerealis. The purpose of the current study was to evaluate the utilization of polymerase chain reaction (PCR) in the diagnosis of genital campylobacteriosis in samples obtained from bull prepuce aspirate, cow cervical mucus, and abomasum contents of aborted fetuses, collected into enrichment medium. Five different DNA extraction protocols were tested: thermal extraction, lysis with proteinase K, lysis with guanidine isothiocyanate, lysis with DNAzol, and lysis with hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB). The specificity, sensitivity, and technical application of the PCR assay were also evaluated with clinical samples and compared to bacterial isolation by standard culture. DNA extraction by the CTAB protocol provided better results in PCR, and it was able to detect 63 colony-forming units per ml of C. fetus.Out of 277 clinical samples tested, 68 (24%) were positive for Campylobacter fetus using PCR, while only 8 (2.8%) of the samples were positive by bacterial isolation in solid medium, proving the superiority of the PCR technique when compared to the standard isolation method, and providing evidence for its usefulness as a better screening test in cattle for the diagnosis of bovine genital campylobacteriosis. amostras foram positivas por isolamento bacteriológico, provando a superioridade da técnica de PCR quando comparada com métodos padrão de isolamento, e fornecendo evidências de sua utilização como um teste de melhor projeção para diagnóstico em campilobacteriose genital bovina.

Prevalence and risk factors associated with bovine genital campylobacteriosis and bovine trichomonosis in the state of Pernambuco, Brazil

“…According to Leal et al (2012), the sensitivity and specificity of the tests used to diagnose this type of infection are the principal causes of variations in prevalence results. One way of minimizing these variations is to use a more sensitive technique, such as PCR, to confirm the results and/or identify the agent directly (Schulze et al 2006;Groff et al 2010). In addition, other factors such as the age of the animals (Pellegrin et al 1999 sanitary management of herds can also affect these differences (Mardones et al 2008;Rocha et al 2009;Mai et al 2013).…”

Prevalence of Campylobacter fetus subsp. venerealis in Dairy Cows from Brejo Paraibano, Brazil

“…In order to confirm the results, positive samples were purified after amplification and bidirectional sequenced using the BigDyeTerminator v3.1 Cycle-Sequencing kit 4 , according to the manufacturer's instructions. Sequencing was performed by capillary electrophoretic separation in an ABI 3500 Genetic Analyzer sequencer 4 . Data were collected using Data Collection Software 4 and underwent quality inspection through SequencingAnalysis Software 4 .…”

“…Sequencing was performed by capillary electrophoretic separation in an ABI 3500 Genetic Analyzer sequencer 4 . Data were collected using Data Collection Software 4 and underwent quality inspection through SequencingAnalysis Software 4 . After sequencing, the contigs were submitted to BLAST in the NCBI GenBank database (www.ncbi.nlm.nih.…”

Campylobacter fetus em bovinos no estado do Rio Grande do Sul

“…A coleta das amostras de machos e fêmeas foi realizada por aspirado prepucial e cervical, utilizando bainha de inseminação artifi cial (IA) IMV (Instruments de Médecine Vétérinaire Tecnologies ® ) francesa estéril, conectada em seringa de 20 a 60mL, e nos fetos abortados nessa coleta foi efetuada com auxílio de agulha e seringa estéril de 60mL. As amostras foram acondicionadas em meio de transporte e enriquecimento (TEM) (LANDER, 1990) e remetidos em até 48 horas após a colheita em temperatura ambiente ao laboratório, onde foram incubadas a 37°C durante cinco dias, para posterior extração de DNA e PCR, de acordo com GROFF et al (2010).…”

“…As condições para a extração e amplifi cação de DNA seguiram as descrições de HUM et al (1997), com modifi cações realizadas por VARGAS et al (2003) e GROFF et al (2010. Os primers utilizados foram espécie específi cos, MG3F (5'-GGTAGCCGCAGCTGCTAAGAT-3') e MG4R (5'-TAGCTACAATAACGACAACT-3') com um amplicon de 750 pb (GROFF et al, 2010). Os produtos de amplifi cação da técnica de PCR foram verifi cados em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídio e visualizado em transluminador de luz ultravioleta.…”