Introdução: O objetivo deste estudo foi analisar o conhecimento, a atitude e a prática dos universitários da área da saúde que já tiveram relações sexuais, sobre o uso do preservativo como método de prevenção das infecções sexualmente transmissíveis (IST). Metodologia: Estudo descritivo do tipo inquérito sobre Conhecimento, Atitude e Prática, com delineamento transversal e abordagem quantitativa. Foi executada em formato on-line, cujas informações foram obtidas por meio da aplicação de um questionário durante o período de setembro a dezembro de 2021. A análise de dados foi realizada por meio dos softwares JASP 0.9.1.0 e BioEstat 5.0. Resultados: Dos 162 participantes, 64.8% possuíam conhecimento adequado; 52.5%, atitude adequada; e 98.1%, prática inadequada em relação à prevenção. O conhecimento esteve associado com a religião (p=0.015), frequência de realização de testes rápidos (p=0.016) e diagnóstico prévio de IST (p=0.029); a atitude esteve associada com a renda familiar (p=0.027), procedência (p=0.017) e sexo (p=0.000); houve associação da prática com o relacionamento (p=0.040). Discussão: O acesso apropriado a meios de prevenção e de informações favorece melhores atitudes e práticas em relação ao uso dos preservativos. Conclusão: Os universitários podem estar vulneráveis às IST, sendo importante ações educativas voltadas à adesão do preservativo.