European sea bass (Dicentrarchus labrax) aquaculture is a thriving industry in Spain where it reached about 23,500 t and a market value of approximately 133 million euros. However, most of the sea bass farms produce a high percentage of males (70-90%) since the rearing temperature is increased during the initial stages of development to speed up development and growth. This is a problem because in this species, generally, females exhibit higher growth rates than males. This situation is aggravated as nearly 30% of these males reach puberty precociously during the first year of life, before attaining commercial size. Puberty is accompanied by a decrease in growth rates as energy diverts towards gonadal growth instead of somatic growth. In addition, it comes along with muscle waste and losses in the organoleptic properties of the meat. Because of these biological responses to captive breeding, there is a great need to understand the reproductive process and its control under intensive production conditions. The main objective of this thesis is to increase the knowledge of European sea bass reproduction. It is focussed on the role of the retinoic acid (RA) signalling pathway during early development and puberty.
Using a costume-made sea bass oligomicroarray we found several groups of genes that were differentially expressed in testis during the onset of male puberty. One of these groups included genes that belong to the RA signalling pathway. RA is the active form of vitamin A and is known to be essential for the onset of meiosis in tetrapods, although its role in fish is yet to be confirmed. These results prompted us to deepen on the possible role of the RA signalling pathway in gonad development and gametogenesis. An in silico analysis allowed us to describe for the first time the structure, phylogeny and evolutionary history of several genes and proteins involved in the synthesis and degradation of RA in the European sea bass. After an exhaustive histological study of gonad development, we could accurately identify specific stages of ovarian and testicular differentiation in this species. The expression of the main genes of the RA signalling pathway in specific stages of gonad development confirmed its role in the onset of puberty. Finally, an in vitro culture system of testicular explants from juvenile prepubertal fish and of testicular preparations from adult fish were set up to study the role of this pathway in the onset of puberty in sea bass males. The functional responses of genes related to RA transport, synthesis, degradation and receptor signaling were evaluated in the presence of stimulators and an inhibitors of the pathway and in different meiosis scenarios.
The results show that in the sea bass: a) the onset of meiosis coincides with an increase of 11KT levels and involves several pathways, including RA signalling; b) the enzymes related to RA synthesis and degradation have all the structural features to fulfil their specific functions; c) there is a well conserved evolutionary history of the enzymes involved in RA synthesis and degradation; d) the absence of stra8, a meiosis gatekeeper present in vertebrates and also in some fish, suggests that RA signaling in this species does not occur through the transduction of this particular gene; e) the genes involved in the RA signaling pathway are evolutionarily well conserved and play an important role in gonad development and gametogenesis; f) the expression dynamics of cyp26a1 during gonad development makes it an excellent molecular marker for the onset of meiosis.
This thesis increases the understanding of the early molecular and endocrine events leading to puberty in the European sea bass by characterizing the RA signaling pathway. Moreover, it provides new questions and opens a novel research line to study the role of RA in puberty.
La acuicultura de la lubina Europea (Dicentrarchus labrax) es una industria pujante en España que alcanza unas 23.500 t y un valor de mercado cercano a 133 millones de euros. Sin embargo, la mayoría de las piscifactorías produce un elevado porcentaje de machos (70-90%) ya que, para acelerar el desarrollo y el crecimiento, se aumentan las temperaturas de cultivo durante las primeras etapas de vida. Esto supone un problema en la lubina ya que generalmente las hembras presentan mayores tasas de crecimiento que los machos y que el 30% de estos alcanza la pubertad precozmente durante el primer año de vida, antes de llegar a la talla comercial. Además, la pubertad está acompañada por una disminución de las tasas de crecimiento somático que implica un desgaste muscular y pérdidas en la calidad organoléptica de la carne. Debido a estas respuestas biológicas, existe una gran necesidad de comprender el proceso reproductivo y su control en condiciones intensivas de producción. El objetivo general de esta tesis es contribuir al conocimiento de la reproducción de la lubina europea, y se centra en el estudio de la ruta de señalización del ácido retinoico (RA) durante estados tempranos del desarrollo y la maduración sexual. La utilización de un oligomicroarray de lubina, indicó la existencia de varios genes con expresión diferencial al inicio de la pubertad en machos. Entre ellos seleccionamos un grupo que incluía genes de la vía de señalización del RA, la forma activa de la vitamina A, fundamental para el inicio de la meiosis en tetrápodos. Un análisis in silico nos permitió describir por primera vez, la estructura, filogenia y la historia evolutiva de genes y proteínas implicados en la síntesis y degradación del RA. Tras un exhaustivo estudio histológico del desarrollo gonadal pudimos identificar con exactitud estados específicos de la diferenciación ovárica y testicular. El estudio de la expresión de los principales genes de la ruta de señalización del RA en estados específicos del desarrollo gonadal sirvió para demostrar su papel en el inicio de la pubertad. Finalmente, se puso a punto un sistema de cultivo in vitro de explantes testiculares de individuos prepúberes tanto juveniles como adultos para el estudio funcional y la determinación del papel de la ruta de señalización del RA en el inicio de la pubertad en machos. Con este fin se evaluó la respuesta funcional de los genes relacionados con el transporte, síntesis, degradación y señalización del RA ante la presencia de estimuladores e inhibidores de la vía y en diferentes escenarios de meiosis. Los resultados de la tesis demuestran que en la lubina: a) el inicio de la meiosis coincide con un aumento en los niveles de 11KT y que involucra varias rutas, entre ellas la de señalización del RA; b) las enzimas relacionadas con la síntesis y degradación del RA poseen todas las características estructurales para poder cumplir su función; c) existe una historia evolutiva bien conservada de las enzimas implicadas en la síntesis y degradación del RA, d) al igual que en otros teleósteos, la ausencia de stra8, marcador específico de meiosis en tetrápodos, sugiere que la señalización del RA en esta especie no ocurre a través de la transducción de este gen en particular; e) los genes implicados en la vía de señalización del RA están conservados, igual que en otros vertebrados, y juegan un papel relevante en el desarrollo gonadal y la gametogénesis, f) la dinámica de expresión del gen cyp26a1 durante el desarrollo gonadal le convierte en un excelente marcador molecular del inicio de la meiosis. Esta tesis contribuye al conocimiento del inicio de la pubertad en la lubina al caracterizar por primera vez la ruta de señalización del RA en esta especie y al proponer herramientas moleculares para su estudio. Además, aporta nuevas preguntas y abre una importante línea de investigación para el estudio del RA en la pubertad
