Redirection of miRNA‐Argonaute Complexes to Specific Target Sites by Synthetic Adaptor Molecules

Bolz, Mathias; Thomas, Laura; Scheffer, Ute; Kalden, Elisabeth; Hartmann, Roland K.; Göbel, Michael

doi:10.1002/cbdv.202000272

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“…Whenever synthetic molecules are intended to adopt the function of such DNA/RNA regulators, e. g ., as artificial transcription factors binding a new recognition site, it is worth considering a redirection strategy: Bifunctional adaptor molecules may capture the protein of interest and guide it to the designed new binding site. This strategy is applicable to many kinds of proteins, e. g ., to RISC complexes acting on mRNAs [51] . In the present study, we have investigated the chemical aspects of SP1 redirection.…”

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

Redirection of the Transcription Factor SP1 to AT Rich Binding Sites by a Synthetic Adaptor Molecule

Bolz

Scheffer

Kalden

et al. 2021

Helvetica Chimica Acta

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The ubiquitous transcription factor SP1 binds to a GC rich consensus sequence. Here we describe an adaptor molecule that mediates binding of SP1 to a non‐cognate DNA site rich in AT. The adaptor is comprised of a Dervan‐type hairpin polyamide with high affinity to an AT rich hexamer duplex. It also carries a 27mer DNA that contains the SP1 consensus sequence. The synthesis and purification of the polyamide‐DNA conjugate is reported. Pulldown experiments and western blot analysis demonstrate adaptor mediated binding of SP1 to the hexamer duplex TTGTTA.

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Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

Redirection of the Transcription Factor SP1 to AT Rich Binding Sites by a Synthetic Adaptor Molecule

Bolz

Scheffer

Kalden

et al. 2021

Helvetica Chimica Acta

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“…Possible applications may comprise the trapping of miRNA-Argonaute complexes and their redirection to novel target sites in non-cognate mRNAs. [48] Experimental Section HPLC analysis of the reductive activation of conjugates 3-5 with glutathione (Figure 1). A 20 μM solution of conjugate 3, 4, or 5 (130 mM MES buffer pH 7.0, 130 mM NaCl) was incubated with 0.5 mM or 10 mM GSH in a polyethylene vial (total volume 140 μL) and kept at 37 °C.…”

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

“…Reductive activation of quinone methide precursors thus should be useful to trigger the crosslinking of nucleic acids at cellular GSH concentrations. Possible applications may comprise the trapping of miRNA‐Argonaute complexes and their redirection to novel target sites in non‐cognate mRNAs [48] …”

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

Directed Crosslinking of RNA by Glutathione‐Triggered PNA‐Quinone‐Methide‐Conjugates

2022

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Quinone methide precursors protected with alkyldithiomethyl groups have been synthesized and converted into PNA conjugates. Stable in the absence of reducing agents, the electrophilic quinone methide is released by glutathione in concentrations typical for the cytosol. Self‐alkylation then occurs or crosslinking of RNA when hybridized with complementary strands. Fastest reactions are seen for the sterically least hindered compound.

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“…Die Durchführbarkeit eines Pulldowns wurde im Arbeitskreis bereits von Mathias Bolz mit einer 7mer LNA und dem anschließenden Nachweis des Argonautenproteins demonstriert. [211] Um besser zu verstehen, warum dies bisher mit einem PNA-Konjugat nicht möglich war, wäre es sinnvoll, den Pulldown zunächst mit einem rekombinanten RISC in einem minimalen in vitro System durchzuführen. So kann leichter festgestellt werden, ob Proteine oder andere Bestandteile des Zelllysats den Pulldown beeinträchtigen und das Konjugat erfolgreich an den RISC bindet.…”

Section: Zusammenfassung and Ausblickunclassified

“…Abbildung 129: Westernblot der Inkubation von PNA6-69 mit Zelllysat. Spur 1: Referenz AGO-Protein (isoliert durch Pulldown mit 7mer LNA[211] ), Spur 2: Zelllysat, Spur 3: Marker, Spur 4: 24 h inkubiert, Spur 5: 4 h inkubiert. (Primärer Antikörper: AGO2 Antikörper, Rabbit PAb, IgG; Sekundärer Antikörper: Goat anti-Rabbit IgG (H+L), DyLight 633)…”

unclassified

Photo- und redoxaktivierbare Chinonmethide zur Alkylierung von RNA

Hornung¹

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RNA ist vor allem als Vermittler von Erbinformationen bekannt. Doch neben der Translation in Proteine ist sie auch maßgeblich an regulatorischen Prozessen in der Zelle beteiligt. So kommen in vielen Organismen Argonautenproteine vor, die zusammen mit microRNA einen Komplex bilden, der in der Lage ist, mRNA zu spalten oder auf andere Weise deren Translation zu unterdrücken. Da die Deregulierung von microRNA bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Parkinson oder Alzheimer auftritt, wurden in dieser Arbeit Alkylanzien entwickelt, die zur besseren Inhibierung von microRNA beitragen sollen. Als Alkylierungsmittel wurden ortho-Chinonmethide verwendet, die zunächst in geschützter Form synthetisiert wurden und nach Aktivierung mit einer Nukleobase reagieren können. Für die Erkennung der miRNA-Sequenz wurden diese zu einem Konjugat mit Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) verbunden. Es wurden zwei Arten von Chinonmethid-Präkursoren hergestellt: Mit o Nitrobenzyl photolabil geschützte, die sich mit Licht der Wellenlänge 365 nm aktivieren lassen, und über ein Disulfid geschützte, die mithilfe eines Reduktionsmittels aktiviert werden. Die photolabil geschützten Derivate lassen sich damit gezielt örtlich und zeitlich aktivieren. Vom reduktiv aktivierbaren Präkursor wurden drei Derivate mit sterisch unterschiedlichen Resten am Disulfid (Benzyl-, Isopropyl- oder tert-Butyl-Rest) hergestellt, die einen Einfluss auf die Kinetik der Entschützung haben. Diese Derivate können nach Eintritt in eine Zelle durch die dort vorherrschende hohe Glutathion-Konzentration aktiviert werden, während sie extrazellulär unreaktiv sind. Zunächst wurde die Kinetik eines photolabil geschützten Konjugats ohne RNA untersucht. Hier kommt es nach Bestrahlung zur Selbstalkylierung, bei der die Nukleobasen der PNA angegriffen werden. Bei 37 °C erfolgte dies mit einer Halbwertszeit von 0.43 h unter Annahme einer Reaktion 1. Ordnung. Die Kinetik der Alkylierung der komplementären RNA ließ sich durch zwei parallel ablaufende Reaktionen 1. Ordnung abbilden. Die Schnelle hatte eine Halbwertszeit von 0.42 h und die Langsame 11 h mit einer Ausbeute von 73 % nach 168 h. Bei Bestrahlung des Konjugats und erst anschließender Zugabe der RNA wurde ebenfalls eine Halbwertszeit von 11 h bei einer einzelnen Reaktionen 1. Ordnung erhalten. Dies lässt sich mit der Reversibilität mancher Reaktionsprodukte erklären. Die schnelle Reaktion entspricht der direkten Reaktion des Chinonmethids mit der RNA, die langsame entsteht durch Umlagerung von reversiblen Addukten. Die Analyse der RNA-Alkylierung erfolgte mithilfe von denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese, bei der in Abhängigkeit der Gel-Temperatur scheinbar unterschiedliche Kinetiken gemessen wurden. Dies ist ebenfalls eine Folge der Reversibilität. Bei 57 °C kann ein Teil der Bindungen zwischen RNA und den Konjugaten brechen und es wird am Anfang der Reaktion eine geringere Ausbeute gemessen als bei 25 °C Geltemperatur. Die Ausbeute nach 168 h änderte sich jedoch nicht, da im Verlauf der Reaktion die reversiblen Addukte in irreversible umgewandelt werden. Mit miRNA-20a als Ziel wurden mit einem 10mer Konjugat zunächst nur 13 % Ausbeute nach 72 h und mit einem 15mer Konjugat 41 % nach 75 h erreicht. Durch internen Einbau des Chinonmethid-Präkursors in die PNA, sodass es einem Adenosin der RNA gegenübersteht, konnte die Ausbeute auf 75 % nach 72 h gesteigert werden, da Adenosin bevorzugt alkyliert wird. Bei den reduktiv aktivierbaren Chinonmethid-Präkursoren waren alle synthetisierten Konjugate in Puffer ohne Glutathion (GSH) stabil. Die Reihenfolge der Reaktionsgeschwindigkeit der Disulfidspaltung war bei 0.5 mM und 10 mM GSH: Benzyl > Isopropyl > tert-Butyl. Die Halbwertszeit bei 10 mM GSH betrug weniger als 5 min (Benzyl-Konjugat) bis 2 h (t Butyl Konjugat). Jedoch bildeten sich mit allen Konjugaten bei 10 mM GSH auch Addukte mit GSH. Die Reaktivitätsreihenfolge blieb bei der Alkylierung von RNA erhalten. Allein das Benzyl-Konjugat erreichte bei einer GSH-Konzentration von 0.5 mM schon die gleiche Reaktionsgeschwindigkeit wie das photolabil geschützte Chinonmethid. Bei 10 mM GSH erreichten die Derivate zwar nach wenigen Stunden ihre maximale Ausbeute, diese betrug jedoch nur 23 % (tert-Butyl-Konjugat) bis 43 % (Benzyl-Konjugat), da die Chinonmethide auch durch GSH als Nukleophil abgefangen werden. Mit einem Konjugat, das ein photolabiles Chinonmethid sowie Biotin trägt, wurde ein Fluoreszenzpulldown mit Cy5-markierter RNA durchgeführt. Hier zeigte die bestrahlte Probe eine deutlich höhere Fluoreszenz (6.8x), als eine unbestrahlte Vergleichsprobe. Bei einem Pulldown-Versuch mit miRNA-20a bzw. mit RISCs aus HeLa-Zelllysat konnte das Argonautenprotein jedoch nicht eindeutig mittels Westernblot nachgewiesen werden. Anhand des reduktiv aktivierbaren Benzyl-Konjugats konnte gezeigt werden, dass sich das Konjugat in Zelllysat zersetzt und nur ein Teil zu Addukten mit Nukleobasen reagiert. Die Ursache wurde in der hydrolyselabilen Abgangsgruppe gesehen, sodass weitere photolabil geschützte Derivate mit Dimethylamino-, Trimethylammonium-, Pivaloylester- und Benzoylestergruppe synthetisiert wurden. Von diesen war nur das Benzoylester-Konjugat in der Lage, RNA mit 72 % Ausbeute nach 48 Stunden zu alkylieren. Zudem war es für mindestens 1 h in Zelllysat stabil.

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Redirection of miRNA‐Argonaute Complexes to Specific Target Sites by Synthetic Adaptor Molecules

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Redirection of the Transcription Factor SP1 to AT Rich Binding Sites by a Synthetic Adaptor Molecule

Redirection of the Transcription Factor SP1 to AT Rich Binding Sites by a Synthetic Adaptor Molecule

Directed Crosslinking of RNA by Glutathione‐Triggered PNA‐Quinone‐Methide‐Conjugates

Photo- und redoxaktivierbare Chinonmethide zur Alkylierung von RNA

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