O desenvolvimento de novos quimioterápicos é premissa da comunidade científica nos últimos anos, principalmente por meio do uso de plantas e outras fontes naturais. Nesse contexto, análises de citotoxicidade e efeito residual têm se tornado essenciais para o estabelecimento de novas terapias. Portanto, este estudo tem como objetivo avaliar os efeitos citotóxicos e residuais do extrato etanólico da casca do pequi (EEPP) sobre as células do osteossarcoma canino. Para isso, foram utilizadas análises de viabilidade celular, citotoxicidade, IC50 e sobrevida celular após terapia nos tratamentos de 24, 48 e 72 horas. Utilizou-se o delineamento de blocos ao acaso, utilizando-se a Análise de Variância com teste posthoc de Tukey para comparação dos tratamentos, considerando significância de 5%. O extrato não mostrou nenhum efeito citotóxico em 24 horas de tratamento, mas um efeito protetor, ou possivelmente um efeito indutor de mitose nas células de osteossarcoma. Porém, em 48 e 72 horas, encontramos citotoxicidade gradativa favorecendo o controle efetivo das células neoplásicas, obtendo-se, em média, 55% de citotoxicidades nas concentrações de 10 a 100 µg / mL. Os valores de IC50 foram 4,05 µg / mL para o grupo de 48 horas e 4,53 µg / mL para o grupo de 72 horas. O efeito residual do tratamento reduziu o crescimento celular após a exposição ao extrato. O fator de sobrevivência foi menor (18,81%) no grupo de 72 horas, com concentração de 10 µg / mL e maior (81,33%) no grupo de 48 horas, com concentração de 100 µg / mL. Esses resultados sugerem que o extrato etanólico da casca do pequi promove aumento da viabilidade celular em 24 horas, ação citotóxica em exposições acima de 48 horas e efeito residual dependente do tempo nas células do osteossarcoma canino.