Separation and Cryopreservation of lmmune Competent Polymorphonuclear Granulocytes (PMN) for Intrauterine Inoculation in Equine Endometritis

Abstract

ZusammenfassungAus Sper-rderblut von 6 Stuterr wurden neutrophrle Granulozfen mittels hypotoner Erythrozytenlyse und Zentrrfugation separiert und tiefgefroren in Makrotüb konserviert. Für den Einfriervorgang wurde ein Kryoprotektivum bestehend aus Pferde-Blutplasma und DMSO (5%) sowie e in Pr o tok o l l m it ei n erEin fri ert em pe rat u rku rve( 4b i s-70 "C1 "C/min ; -71 b is -14 0' C1 O"C /min ; -14 1 b i s-l96 "CTa u che ni nfl üssig en St ickstoffl entwickelt. Vitalität, Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und Phagozytoseaktivität der aufgetauten PMN wurden mittels durchflußzyto-metrischer Meßmethoden mit frischen, nicht gefrorenen Zellen des identischen Spenderlieres verglichen. lm Vitalitätstest wurden mit 95,506 resp. 94,5o./o membranintakten PMN glejchwertige Resultate bei den Kontrollen resp. gefrorenen/aufgeiauten PMN-Populationen gemessen. Die Phagozytoseaktivität opsonisierter Bakterien war mit 81,0 % resp. 80,0 % in den frischen resp. gefrorenen/aufgetauten PMN-Populationen iderrtisch, Die gefrorenen/aufgetauten PMN zeigten eine signifikant höhere Kapazität zur ROSBildung nach Stimulation mit Pl\/A. r-ria trr^öhnicca Äiocor at;lig demonstrieren die Brauchbarkeit des Verfahrens zur Gewinnung und Gefrierkonservierung einer vitalen und immunkompetenten PMN-Population für den geplanten therapeutischen Einsatz bei bakteriell bedingter equiner Endometritis.Schlüsselwörter: Stute, Endometritis, neutrophile Granulozyten, Kryokonservierung Separation and Cryopreservation of lmmune Competent Polymorphonuclear Granulocytes (PMN) for Intrauterine Inoculation in Equine EndometritisPMN from blood of 6 mares were separated using hypotonic lysis of erythroc\4es and centrifugation, After addition of a solution of equine plasma and DMSO (5%) the PMN were frozen. A method for freezing was developed with control of temperature decreasing rate. Tempera ture curve was 4 to -70"C at 1'Clmin, -71 to -140"C at 1O"C/min, 140 to -196"C diving. To verify cell survival rate after thawing as well as its functional capacity i.e. phagocytosis and respiratory burst (ROS) an experiment using flow cytometry assay was pedormed. 95.5 o/o resp. 94.5 o/o of propidium iodide negative PMNs indicate cell membrane integrity of both the fresh and frozenlthawed PMN populations. Phagocytosis of opsonized bacteria was similar in both populations of cells i.e. 81.0 % resp. 80.0 % of the tresh resp. frozenlthawed PMNs. Increasing capacity for generation of reactive oxygen species after stimulation by PMA was obserued with frozenlthawed neutrophils. The results of this study indicate the practicability of the method for achieving and cryopreservation of a vital and immune competent PMN oooulation for intended theraoeutic use in susceptible mares for endometritis.