Sexagem de espermatozoides bovinos por centrifugação em gradiente descontínuo de densidade de Percoll

Abstract

RESUMO -O objetivo neste trabalho foi desenvolver um método de seleção do sexo de espermatozoides bovinos por centrifugação em gradiente de densidade de Percoll. Utilizou-se sêmen congelado de touros mantidos em regime de colheita de sêmen. A fração de espermatozoides X ou Y foi separada por centrifugação em treze diferentes gradientes de densidade de Percoll formados por 1 a 12 camadas com densidades que variaram de 1,004 g/mL a 1,123 g/mL. As soluções com diferentes densidades foram preparadas misturando-se, em proporções diferentes, meio de cultura Hank's e uma solução estoque composta de NaCl 1,5 M e Percoll (1:9, v/v). Sobre cada gradiente foi colocado um total de 50 × 10 6 espermatozoides descongelados em 0,7 mL de meio Hank's e centrifugados a 250 X g por 30 minutos, em rotor horizontal, a 25°C. Os espermatozoides das frações superior e inferior foram tratados com Quinacrina Mustarda e analisados (200 deles) quanto à presença do corpúsculo-F. Dos espermatozoides encontrados no sedimento de dois gradientes, compostos de 8 e 12 frações com densidades variando entre 1,050 a 1,120 g/mL e 1,044 a 1,123 g/mL, respectivamente, visualizaram-se 25% com corpúsculo-F e os 75% restantes prováveis portadores do cromossomo X. O aumento na porcentagem de espermatozoides X após a centrifugação em gradiente de densidade permitirá que esse método de sexagem seja usado em larga escala na produção comercial de carne e leite bem como no teste de progênie. Palavras-chave: Bos taurus, seleção do sexo, sêmenSex selection in bovine spermatozoa by using Percoll discontinuos density gradient centrifugation ABSTRACT -The objective of this work was to develop a bovine spermatozoid sex selection method by using Percoll density gradient centrifugation. It was used frozen semen of bulls kept in semen collection regime. Fraction X or Y was separated by centrifugation in three different Percoll density gradient formed by 1 to 12 layers with densities varying from 1.004 g/mL to 1.123 g/mL. Solutions with different densities were prepared by mixing, at different proportions, Hank's culture medium and a stock solution composed of NaCl 1.5 M and Percoll (1:9, v/v). On each gradient, it was put 50 × 10 6 spermatozoids thawed in Hank's medium and centrifuged at 250 X g for 30 min in a horizontal rotor, at 25°C. The spermatozoids in the superior and inferior fractions were treated with Mustard Quinacrine and analyzed (200 spermatozoids) for the presence of F-body. Of the spermatozoids found in the sediment of the two gradients, composed of 8 and 12fractions with densities varying from 1.050 to 1.120 g/mL and 1.044 to 1.123 g/mL, respectively, it was identified 25%with the F-body and the other 75% were probably X chromosome-bearing spermatozoids. Increase in percentage of the X-spermatozoid after density gradient centrifugation will allow this system of spermatozoid sexing to be used in large scale in commercial production of meat and milk as well as for progeny tests in bovines. IntroduçãoA sexagem de espermatozoides tem valor econômico signifi...

Estudo sobre as diferentes técnicas de sexagem de espermatozoides

“…Após a centrifugação os espermatozoides foram separados em duas frações, o sobrenadante foi descartado e o sedimento das duas frações foi aspirado nos gradientes de oito e 12 camadas. Os espermatozoides recuperados foram 25% e 75% de Y e X, respectivamente (20).…”

“…Sucessivas centrifugações causam danos às células espermáticas, desta forma, a diminuição no numero de centrifugações diminui as injurias causadas aos espermatozoides (23,24). Foi testado um novo gradiente composto de soluções isotônicas que permite que em uma única centrifugação haja separação de impurezas dos espermatozoides viáveis e esses ainda serem separados em X e Y, Uma pesquisa desenvolvida com separação de espermatozoides X e Y com gradiente de densidade Percoll revelou resultados positivos quanto ao uso da técnica uma vez que após a centrifugação houve a separação dos espermatozoides por sexo com acuidade de 75% e 25% de taxa de recuperação de espermatozoides, apesar de ser uma técnica com menor recuperação comparada a citometria de fluxo o gradiente de densidade é um processo mais rápido e com maior porcentagem de motilidade (20).…”

Centrifugação em gradiente de densidade

“…O sêmen sexado contempla células separadas para conter uma amostra que produzirá uma prole masculina ou feminina para atender às exigências dos criadores de acordo com a necessidade de produção ou do mercado (4). Uma vez que seleciona animais com aptidões específicas, que pode ser favorecida por uma progênie de sexo pré-determinado, a sexagem espermática beneficia o manejo e a eficiência reprodutiva (5) e maximiza o progresso genético entre gerações (6).…”

“…Além do ponto de vista zootécnico, a sexagem espermática também tem importância na reprodução humana assistida e em animais ameaçados de extinção (6,7), utilizando animais domésticos como modelo experimental (8). Recentemente, o sêmen sexado foi empregado em golfinhos para aumentar o número de fêmeas em cativeiro e permitir a reprodução dessa espécie (9).…”

“…No entanto, sua execução demanda equipamentos sofisticados, é muito dispendiosa e tem demonstrado diminuir a fertilidade dos espermatozoides, em vista dos danos causados pela técnica (3,7). Apesar de ainda não possuir repetibilidade e reprodutibilidade que a torne uma técnica confiável e segura, uma alternativa é a centrifugação em gradiente de densidade devido à simplicidade de execução e por não exigir grandes investimentos em equipamentos (6,13).…”