Significance of Studying the Cytotoxicity of Bacterial Biofilm for Assessing the Potential Ability of the Microbiota to Prolong the Inflammatory Phase of the Wound Process

Abstract

Введение. Проявление цитотоксичного влияния клинических штаммов бактерий на культуру фибробластов, по данным ряда авторов, отражает патогенный потенциал микробиоты, расцениваемый как фактор риска развития осложнений, сопровождающихся снижением функциональной активности или гибелью клеток. Наличие в хронической ране бактерий – продуцентов биопленки, обладающих цитотоксичностью, способно пролонгировать фазу воспаления, что определяет показания к использованию эффективных методов обработки раны.Цель. Установить критерии оценки цитотоксичности матрикса бактериальной биопленки по ассоциированному с этиологической структурой микробиоты эффекту влияния биопленки на культуру фибробластов и развитие процесса воспаления.Материалы и методы. Проведена оценка цитотоксического влияния компонентов матрикса биопленки бактерий, выделенных из ран, на культуру фибробластов кожи на основании использования методов исследования жизнеспособности (количества поврежденных клеток по результатам ЛДГ-теста, количества CD95+ и 7-AAD+ клеток), пролиферативной активности (времени удвоения, индекса пролиферации), а так-же экспрессии поверхностных иммунофенотипических маркеров: эластазы (CD10), рецептора гиалуроновой кислоты и матриксных металлопротеиназ (CD44), экто-5’-нуклеотидазы (CD73), рецептора коллагена (CD49b/CD29), регулятора адгезии и миграции (CD90), корецептора для трансформирующего фактора роста (CD105), виментина (методом проточной цитофлуориметрии).Результаты. Для первичных культур фибробластов грануляционной ткани острыхран был характерен более высокий уровень экспрессии основных маркеров, отражающих иммунофенотип фибробластов, – CD44, CD90, CD73, CD10 CD49b/CD29 (более 60–80% клеток), и более низкие значения 7-AAD+ и CD95+клеток (менее 22%), чем таковые для фибробластов хронических ран, колонизированных бактериями – продуцентами биопленки. Показатели отражают нарушение состояния фибробластов в процессе хронизации воспаления и могут быть рекомендованы в качестве критериев дифференциальной диагностики острой и хронической раны с целью обоснования соответствующей лечебной тактики. Бактериальные компоненты матрикса биопленки P. aeruginosa, K. pneumoniae, S. aureus, E. faecalis проявляли цитотоксичное влияние на культуру фибробластов здоровой кожи в эксперименте, что выражалось в изменении показателей пролиферативной активности (времени удвоения, индекса пролиферации, количества поврежденных клеток по результатам ЛДГ-теста), нарушении экспрессии на фибробластах CD10 (маркер эластазы), CD44 (рецептор для гиалуроновой кислоты, коллагена и матриксных металлопротеиназ), CD73 (экто-5’-нуклеотидаза), CD90 (регулятор адгезии, миграции фибробластов и организации их цитоскелета), CD49b/CD29 (α2β1-интегрин – рецептор коллагена), развитии апоптоза (по CD95) и гибели (по 7-AAD) фибробластов. Для практического использования лабораторного метода оценки состояния фибробластов, испытывающих на себе влияние компонентов бактериальной биопленки, разработана таблица интерпретации результатов исследования, в которой проявление цитотоксичности выражается в % от показателей контрольной пробы. Метод отражен в инструкции по применению «Метод определения фазы раневого процесса хронической язвы кожи», которая утверждена Министерством здравоохранения Республики Беларусь 16.12.2020, рег. № 127-1220.Выводы. Результаты дополнительно подтверждают вклад микробного фактора в патогенез нарушения репарации и формирования длительно не заживающей раны. Проявление цитотоксичности бактерий, выделенных из хронической раны на культуру аутологичных фибробластов, обосновывает патогенный потенциал микробиоты в плане риска развития осложнений, обусловленных биомедицинским продуктом, – снижения функциональной активности или гибели клеток. Наличие в хронической ране бактерий – продуцентов биопленки, обладающих цитотоксичностью, является критерием пролонгации фазы воспаления и определяет показания к использованию эффективных методов обработки раны для стимуляции перехода фазы воспаления в фазу регенерации. Introduction. The manifestation of the cytotoxic effect of clinical strains of bacteria on the culture of fibroblasts, according to a number of authors, reflects the pathogenic potential of the microbiota, regarded as a risk factor for the development of complications accompanied by a decrease in functional activity or cell death. The presence of biofilm- producing bacteria with cytotoxicity in a chronic wound can prolong the inflammation phase, which determines the indications for the use of effective methods of wound debridement.Purpose. To establish criteria for assessing the cytotoxicity of the bacterial biofilm matrix according to the effect of its influence on the fibroblast culture and the development of the inflammation process associated with the etiological structure of the microbiota.Materials and methods. The cytotoxic effect of the components of the biofilm matrix of bacteria isolated from wounds on the skin fibroblast culture was assessed based on the use of methods for studying viability (the number of damaged cells according to the results of the LDH test, the number of CD95+ and 7-AAD+ cells), proliferative activity (doubling time, proliferation index ), as well as the expression of surface immunophenotypic markers: elastase (CD10), hyaluronic acid receptor and matrix metalloproteinases (CD44), 5’-ecto-nucleotidase (CD73), collagen receptor (CD49b/CD29), adhesion and migration regulator (CD90), co -receptor for transforming growth factor (CD105), vimentin (by flow cytometry).Results. Primary cultures of fibroblasts from the granulation tissue of acute wounds were characterized by a higher level of expression of CD44, CD90, CD73, CD10 CD49b/CD29 (more than 60–80% of cells) and lower values of 7-AAD+ and CD95+ cells (less than 22%) than for chronic wound fibroblasts colonized by biofilm-producing bacteria. The indicators reflect the violation of the state of fibroblasts in the process of chronic inflammation and can be recommended as criteria for the differential diagnosis of acute and chronic wounds in order to justify the appropriate treatment tactics. Components of the biofilm matrix P. aeruginosa, K. pneumoniae, S. aureus, E. faecalis showed cytotoxicity on healthy skin fibroblast culture in the experiment, which was expressed in a change in proliferative activity indicators (doubling time, proliferation index, number of damaged cells according to the results of the LDH test), impaired expression on fibroblasts of the main markers (CD10, CD44, CD73, CD90, CD49b/CD29), development of apoptosis (according to CD95) and death (according to 7-AAD) of fibroblasts. For the practical use of the laboratory method for assessing the state of fibroblasts under the influence of bacterial biofilm components, a table for interpreting the results of the study was developed, in which the manifestation of cytotoxicity is expressed as % of the control. The method is reflected in the instructions for use "Method for determining the phase of the wound process of chronic skin ulcers", which was approved by the Ministry of Health of the Republic of Belarus on December 16, 2020, reg. No. 127-1220.Conclusions. The results additionally confirm the contribution of the microbial factor to the pathogenesis of repair disorders and the formation of a long-term non-healing wound. The manifestation of cytotoxicity of bacteria isolated from a chronic wound on a culture of autologous fibroblasts substantiates the pathogenic potential of the microbiota in terms of the risk of developing complications associated with a biomedical product - a decrease in functional activity or cell death. The presence of biofilm-producing bacteria with cytotoxicity in a chronic wound is a criterion for the prolongation of the inflammation phase and determines the indications for the use of effective debridement methods to stimulate the transition of the inflammation to the regeneration phase.