The Crystal Structure, Mutagenesis, and Activity Studies Reveal that Patatin Is a Lipid Acyl Hydrolase with a Ser-Asp Catalytic Dyad

Abstract

Patatin is a nonspecific lipid acyl hydrolase that accounts for approximately 40% of the total soluble protein in mature potato tubers, and it has potent insecticidal activity against the corn rootworm. We determined the X-ray crystal structure of a His-tagged variant of an isozyme of patatin, Pat17, to 2.2 A resolution, employing SeMet multiwavelength anomalous dispersion (MAD) phasing methods. The patatin crystal structure has three molecules in the asymmetric unit, an R-factor of 22.0%, and an R(free) of 27.2% (for 10% of the data not included in the refinement) and includes 498 water molecules. The structure notably revealed that patatin has a Ser-Asp catalytic dyad and an active site like that of human cytosolic phospholipase A(2) (cPLA(2)) [Dessen, A., et al. (1999) Cell 97, 349-360]. In addition, patatin has a folding topology related to that of the catalytic domain of cPLA(2) and unlike the canonical alpha/beta-hydrolase fold. The structure confirms our site-directed mutagenesis and bioactivity data that initially suggested patatin possessed a Ser-Asp catalytic dyad. Alanine-scanning mutagenesis revealed that Ser77 and Asp215 were critical for both esterase and bioactivity, consistent with prior work implicating a Ser residue [Strickland, J. H., et al. (1995) Plant Physiol. 109, 667-674] and a Ser-Asp dyad [Hirschberg, H. J. H. B., et al. (2001) Eur. J. Biochem. 268, 5037-5044] in patatin's catalytic activity. The crystal structure aids the understanding of other structure-function relationships in patatin. Patatin does not display interfacial activation, a hallmark feature of lipases, and this is likely due to the fact that it lacks a flexible lid that can shield the active site.

Phospholipase A activity of adenylate cyclase toxin mediates translocation of its adenylate cyclase domain

“…S4). Patatin-like PLAs are most highly homologous to eukaryotic group IV cytosolic PLA 2 α and group VI calcium-independent PLA 2 , which are distinguished by a conserved Ser-Asp catalytic dyad within the active site, with catalytic Ser located in a conserved G-X-S-X-G hydrolase motif, and Asp in a D-X-G/A motif (boldface letters correspond to conserved catalytic residues involved in PLA activity) (36,37). Remarkably, in its 1,706 amino acids long sequence, rich in Gly and Asp residues, ACT harbors a single G-X-S-X-G motif, with a GASAG sequence, which is localized in the predicted membrane-interacting α-helical region (residues 500-700) of ACT.…”

A feed-forward loop amplifies nutritional regulation of PNPLA3

“…The progenitor of the PNPLA family, patatin, comprises ∼40% of the dry weight of potato tubers (13) and has nonspecific lipid acyl hydrolase activity (14) mediated by a serineaspartate dyad (15). PNPLA3 is expressed at the highest levels in adipose tissue of mice (16).…”

Les protéines à domaine patatine

“…Un résidu aspartate strictement conservé (motif Asp-X-Gly/ Ala ou DXG/A, voir Figure 1) constitue avec la sérine cette dyade catalytique. L'implication directe de cette dyade dans l'activité enzymatique de la patatine a été mise en évidence par mutagenèse dirigée [5,6]. De plus, des études cristallographiques ont permis d'élucider la structure tridimensionnelle de la patatine confirmant la présence de ces résidus au coeur du site actif ( Figure 2) [6].…”

“…L'implication directe de cette dyade dans l'activité enzymatique de la patatine a été mise en évidence par mutagenèse dirigée [5,6]. De plus, des études cristallographiques ont permis d'élucider la structure tridimensionnelle de la patatine confirmant la présence de ces résidus au coeur du site actif ( Figure 2) [6]. La protéine présente un repliement de type α/β hydrolase de topologie iné-dite composée de six feuillets β entourés d'hélices α (repliement α/β/α) qui n'est en rien comparable avec ceux classiquement retrouvés dans les lipases [6], ce qui atteste ainsi de la singularité de cette nouvelle famille enzymatique.…”

“…Le repliement est de type α/β/α où l'on observe au centre une série de six feuillets β parallèles en brun, encadrés par des hélices α (en vert). Le site catalytique est représenté dans l'encart en haut à gauche permettant la visualisation des résidus de la dyade catalytique ainsi que les résidus composant le trou de l'oxyanion (en jaune indiqués par les flèches rouges) (d'après [6]). …”