Transformation of alfalfa with a bacterial fusion gene, Mannheimia haemolytica A1 leukotoxin50-gfp: Response with Agrobacterium tumefaciens strains LBA4404 and C58

Abstract

Alfalfa transformed with a portion of the leukotoxin gene from Mannheimia haemolytica was produced to test the feasibility of developing an edible vaccine capable of protecting cattle from pneumonic pasteurellosis. Leukotoxin (Lkt), has been identified as an important protective antigen of M. haemolytica, and a fragment, Lkt50, was shown to produce toxin-neutralizing antibodies in rabbits. The construct chosen for introduction into alfalfa carried lkt50 fused to a green fluorescent protein reporter gene, mgfp5-ER. The fusion gene was driven by either the cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S) or the promoter from a rubisco small subunit (rbcS-3A) gene of pea. The constructs were introduced into alfalfa RSY27 germplasm using two Agrobacterium tumefaciens strains, LBA4404 and C58, producing a number of transformed lines with both A. strains. Although strain C58 had a slower initial response and produced less callus than strain LBA4404, it resulted in higher numbers of transformed embryos and plants. In total, 30 alfalfa lines (91% of those analyzed), each derived from a separate transformation event, produced detectable levels of Lkt50-GFP. Western analysis with anti-Lkt+66 antiserum revealed the presence of both full-length and truncated polypeptides in plants kept in magenta boxes, while plants transferred to the greenhouse produced only the full-length product. Immunoblotting with anti-GFP antiserum provided evidence that part of the GFP moiety was lost in the truncated protein. Southern blot analysis indicated a low number of insertion sites per event.

Obtaining of transgenic alfalfa for improved phytoremediation the petroleum contaminated soils

“…Однако работы носили поисковый характер -частота трансформации была небольшой, генетические конструкции (вектора) содержали только селективные или репортерные гены. В настоящее вре-мя, несмотря на обилие публикаций по успешной агро-бактериальной трансформации люцерны (Rosellini et al, 2007;Zhang et al, 2010), все еще имеются трудности, связанные с необходимостью индивидуального подбора условий трансформации в зависимости от генотипа, типа экспланта, штамма агробактерии и вектора для транс-формации (Nincovic et al, 2004;Ziauddin et al, 2004). В литературе описаны следующие основные подходы, применяемые при агробактериальной трансформа-ции: инкубация эксплантов в суспензии агробактерии (Faragova et al, 2011;Liu et al, 2013;Zhang et al, 2010) в условиях вакуумной инфильтрации; культивирование на газоне агробактерии (Trinh et al, 1998); в редких слу-чаях -трансформация in planta (Weeks et al, 2008).…”

“…В литературе описаны следующие основные подходы, применяемые при агробактериальной трансформа-ции: инкубация эксплантов в суспензии агробактерии (Faragova et al, 2011;Liu et al, 2013;Zhang et al, 2010) в условиях вакуумной инфильтрации; культивирование на газоне агробактерии (Trinh et al, 1998); в редких слу-чаях -трансформация in planta (Weeks et al, 2008). В качестве эксплантов обычно используют эмбриоиды, каллусы, семядоли, гипокотили, листовые диски, а так-же проростки и семена (Nincovic et al, 2004;Ziauddin et al, 2004;Uzelac et al, 2007). В нашей работе были использованы две основные схемы агробактериальной трансформации.…”

High-efficiency phosphinothricin-based selection for alfalfa transformation

“…In vitro leaf-disc transformations were performed as described in Ziauddin et al (2004). Transformations Fig.…”

“…Although transformation efficiencies of 27-47% are routinely obtained with kanamycin-based selection (Ziauddin et al 2004), reported transformation efficiencies for pat/bar selection are in the range of 3.5-16% (D'Halluin et al 1990;Tabe et al 1995;Barbulova et al 2002).…”

Zeolin is a recombinant storage protein that can be used to produce value-added proteins in alfalfa (Medicago sativa L.)

“…It has been frequently used to produce industrial proteins such as enzymes (Austin et al 1995;Ullah et al 2002), biodegradable polymer (Saruul et al 2002), or insect proteinase inhibitor (Thomas et al 1994). Recently, alfalfa has also been used to express pharmaceuticals proteins (Dus Santos et al 2002;Ziauddin et al 2005). This legume species was chosen for the production of C5-1, a monoclonal antibody (Khoudi et al 1999).…”