Two routes for production and purification of Fab fragments in biopharmaceutical discovery research: Papain digestion of mAb and transient expression in mammalian cells

Zhao, Yong-Qi; Gutshall, Lester L.; Jiang, Haiyan; Baker, Audrey; Beil, E.; Obmolova, Galina; Carton, Jill M.; Taudte, Susann; Amegadzie, Bernard Y.

doi:10.1016/j.pep.2009.04.012

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“…In some cases it could be preferable to produce the Fab fragments in high quality by recombinant expression in cell lines and obtain the fragment in sufficient quantity. For example, the Fab fragments produced by recombinant expression were found to be more preferable for the crystallization experiments because of the higher quality of the protein sample [47]. …”

Section: Molecular Biology Research Applicationsmentioning

confidence: 99%

Research Applications of Proteolytic Enzymes in Molecular Biology

2013

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Proteolytic enzymes (also termed peptidases, proteases and proteinases) are capable of hydrolyzing peptide bonds in proteins. They can be found in all living organisms, from viruses to animals and humans. Proteolytic enzymes have great medical and pharmaceutical importance due to their key role in biological processes and in the life-cycle of many pathogens. Proteases are extensively applied enzymes in several sectors of industry and biotechnology, furthermore, numerous research applications require their use, including production of Klenow fragments, peptide synthesis, digestion of unwanted proteins during nucleic acid purification, cell culturing and tissue dissociation, preparation of recombinant antibody fragments for research, diagnostics and therapy, exploration of the structure-function relationships by structural studies, removal of affinity tags from fusion proteins in recombinant protein techniques, peptide sequencing and proteolytic digestion of proteins in proteomics. The aim of this paper is to review the molecular biological aspects of proteolytic enzymes and summarize their applications in the life sciences.

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Section: Molecular Biology Research Applicationsmentioning

confidence: 99%

Research Applications of Proteolytic Enzymes in Molecular Biology

2013

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“…Em comparação à cromatografia de afinidade empregando as proteínas A e G como ligantes, essa técnica apresenta as vantagens de apresentar um menor custo, de possibilitar várias regenerações da coluna sem que suas propriedades sejam alteradas e de permitir a eluição da biomolécula adsorvida em condições mais brandas (Porath, 1992). Alguns estudos tem demonstrado a eficácia da técnica IMAC na purificação de fragmentos de IgG naturais e recombinantes (Xiang et al, 2002;Todorova-Balvay et al, 2004;Zhao et al, 2009). …”

Section: Nos úLtimos Anos Vários Fragmentos De Igg Foram Aprovados Punclassified

PURIFICAÇÃO DE FRAGMENTOS Fab POR IMAC EM AGAROSE-CM-Asp-Co(II)

Mourão¹,

Bueno²

2015

Anais Do XX Congresso Brasileiro De Engenharia Química

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RESUMO -As imunoglobulinas G (IgG) e seus fragmentos Fab, F(ab)' 2 e Fv apresentam aplicações relevantes na área médica e de diagnóstico. O elevado custo de purificação dessas biomoléculas por técnicas de afinidade justifica a investigação de alternativas de baixo custo para a sua purificação. O objetivo deste trabalho é avaliar a eficácia do quelato CM-Asp-Co(II) imobilizado em agarose na purificação dos fragmentos Fab de IgG humana, a partir de uma solução de IgG clivada pela enzima papaína. O efeito do sistema tamponante e do cloreto de sódio foram avaliados. O tampão Hepes na ausência de sal, permitiu obter os fragmentos Fab com pureza superior a 90%. Esse tampão possibilitou a maior recuperação seletiva dos fragmentos, em comparação com o tampão Hepes contendo NaCl e com os tampões, Tris-HCl e fosfato de sódio. Os resultados evidenciaram a potencialidade desse ligante para purificação de fragmentos Fab. INTRODUÇÃOOs fragmentos Fab, F(ab)' 2 e Fv obtidos da clivagem da IgG ou por meio da tecnologia do DNA recombinante, são proteínas que apresentam aplicações relevantes em terapias e diagnósticos. Tais biomoléculas são caracterizadas por possuírem massa molar e tempo de meia-vida inferiores ao da IgG intacta, consequentemente apresentam maior facilidade de penetração nos tecidos alvo e menor tempo de depuração plasmática (Chames et al., 2009). Nos últimos anos, vários fragmentos de IgG foram aprovados pelo FDA (Food and DrugAdministration) e têm sido empregados em diagnósticos por imagem in vivo, nas terapias de doenças degenerativas e cânceres (Hansel et al., 2010). A aplicação dos fragmentos de anticorpos nesses segmentos representa, aproximadamente, 6 bilhões de dólares por ano (Holliger e Hudson, 2005).Para serem empregados nessas aplicações é requerido um elevado grau de pureza da IgG e de seus fragmentos. Tradicionalmente, a purificação dessas biomoléculas é realizada por meio da técnica de cromatografia de afinidade, empregando como ligantes a proteína A ou a proteína G imobilizadas (Huse et al., 2002). No entanto, esses ligantes apresentam algumas desvantagens, tais como o elevado custo, o risco de desnaturação do anticorpo e de desprendimento do ligante da matriz em decorrência das condições de eluição a baixos valores de pH e o risco da inativação do ligante após sucessivos ciclos de purificação (Ayyar et al., 2012). Diante desses inconvenientes, estudos têm sido desenvolvidos visando o emprego de técnicas alternativas à cromatografia de afinidade (Coleman e Mahler, 2003; Yu e Ghosh, 2010) ou de ligantes substitutos das proteínas A e G (Khoury e Lowe, Área temática: Processos Biotecnológicos 1

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“…44. The purified proteins were dialyzed into 20 mM Tris (pH 7.4) with 50 mM NaCl and concentrated before crystallization.…”

Section: Expression and Purification Of Mab15 Fab Mut5 Fab Mut7 Fabmentioning

confidence: 99%

“…44 The purity of the Mut6Fab fragment was assessed by SDS-PAGE with NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (Invitrogen). The purified Fab was dialyzed into 100 mM NaCl and 10 mM NaP i (pH 6.5).…”

Section: Generation Of Mut6 Fabmentioning

confidence: 99%