Untersuchungen über die Anwendbarkeit der Reduktionsmethode zur Bestimmung carboxylendständiger Aminosäuren in Peptiden und Proteinen

Abstract

Die in zwei vorhergehenden Mitteilungen beschriebene Methode der Bestimmung carboxylendsthdiger Aminosiiuren in Peptiden und Proteinen als DNP-Aminoalkohole wurde an zahlreichen synthetischen Peptiden und an Insulin a d ihre Brauchbarkeit untersucht. Die enielten Ausbeuten lngen im allgemeinen urn etwa 90 %, reduktive Spaltungen von Peptidbindungen wurden in keinem Falle beobachtet. Eine Anzahl von DNP-Aminoalkoholen wurde dargastellt und deren chmmatqpphische Trennung ausgearbeitet. Fur die h t i m m u n g carboxylcndstiindiger Aininosiiuren in Peptiden und Proteinen haben erstmals C1. Fromageot und Mitarbb.') vorgeschlagen, dieselben durch Reduktion ihrer freien Carboxylgruppen mit LiAlH, zu markieren und nach Hydrolyse des retiuzierten Peptides als Aminoalkohole zu identifizieren. Cewisse Unsicherheiten der Mcthode, die vor aUem im teilweisen AngrifT von Peptidbindungen durch dtw Reduktionsmittel (vcrgl. 2)) und in der unbefriedigenden Abtrennung und Identi6zierung der Aminoalkohole zu suchen waren, haben wir iibemndens), indem wir zur Reduktion claa bereits von A. C. Chibnall uud M. W. €tees4) benutzte LiBH, auf veresterte P e p tide einwirkcn lieBen und nach Hydrolyse daa aus Aminoakoholon und Amino&uren bestehendo Gemisch mittels Dinitrofluorbenzols (DXFB) in gelbe Dinitrophenyl(DNP)-Derivate uberftihrten. worauf sich di0 DNP-Aminoalkohole auf Grund ihrer &herloslichkeit und des Fehlens saurer Eigenschaften aus hydrogencarbonatdkalischer Lijsung leicht von den DNP-Aminosiruren abtrennen liebn. Denselben Weg der Abtrennung und Identi6zierung haben inzwischen M. J u tisz und Mitarbb.6) beachrittan, allerdings nach vorheriger Reduktion mit LiAlH,, so daB sie die urspriinglichen E n d y p p e n in schlechterer Ausbeute und verunreinigt durch Reduktiomprodukte nicht endstiindiger Aminostiuren als 1)"-Aminoalkohole erhielten. Auch H. J a t z k e w i t z und Nguyen-Dang Tame) haben die Aminoalkoholc in DNP-Derivate iibergefiihrt, wobei es ihnen jedoch nicht gelang, sie i.Hochvak. vollkommen frei von DNE' B zu erhalten. Wir haben diese Verunreinigungen durch Umsetzung mit einer nachtrtiglich zugesetzten Aminosiiure cntfernt, deren DNP-Derivat sich in alkaliecher Usung leicht von den iitherloslichen DNP-Aminoalkoholen abtrennen laat. -_ .-I ) C1. F r o m a g e o t , M. J u t i s z , D. Meyer u. L. Penasse, Biochirn. biophyeica Acta 6,283 [1950]. 2 , Vergl. R. Nystrom u. W. a. Brown, J.Amer.chem.Soc.70,3738[1941)]; A. Uffer u. E. S c h l i t t l e r , Helv. chim.Bcta81,1397 [IQPS]; P. K a r r e r u. B. J. R. Nicolaus, ebenda86,1581 [1952]; V. M. Mi6ovi6 u. M. L. Mihailovi6, J. 0%. Chemistry 18, 1190 [1953]; M. J u t i s z , D. M. M e y e r u. L. P e n a s s e , BuU. Soc. chim. France 1064, 1087. 3, W. GraOmann, H. H o r m a n n u. H. Endres, Chem. Ber. 86,1477 "531. 4) Biochem. J. 48, xlvii [1961]. K, M. J u t i s z , M. P r i v a t de Garilhe, M. S u q u e t u. C. Fromageot, Bull. Soc. Chirn. biol. 86,117 [1964]; vergl. auch M. B. Williamson u. J. M, Passmann, Bioohim. bioph-ysica Acta 16,246 [1954]. e, H. J a t z k...

The Chemistry of Proteins and Peptides

“…The more soluble fraction, procollagen, has apparently a very small number of N-terminal groups, and typical collagen has none unless it is degraded prior to analysis. On the other hand, Grassmann and co-workers (107,108,109) found an appreciable number of amino alcohols formed upon reduction; the yield amounted to about 5 per cent of all of the residues, or one thousand times the N-terminal residues of procollagen. Since the same amount was found with and without prior esterification, the authors concluded that these amino alcohols were derived from originally ester linked C-terminal amino acids, presumably involving the carbohydrate moiety of collagen.…”

“…However, the latter reagent has been reinvestigated quite intensively by Grassmann and co-workers (107,108,109). Those authors conclude that no untoward reactions such as reduction of amide or peptide bonds occurs, even in several hours in boiling tetrahydrofuran; in contrast the results of Crawhall & Elliott indicate appreciable reduction of the amide bonds (110,111).…”

“…reduction of esters is close to quantitative. Without prior esterification, most peptides are quite resistant to reduction, but the C-terminal alanine of insulin is reduced by up to 20 per cent (108) . The reduction products, the amino alcohols, are isolated and determined as DNP-derivatives (89,108).…”

“…Without prior esterification, most peptides are quite resistant to reduction, but the C-terminal alanine of insulin is reduced by up to 20 per cent (108) . The reduction products, the amino alcohols, are isolated and determined as DNP-derivatives (89,108). It is to be hoped that this method can be applied with equal success by others and that its results can be confirmed by other methods.…”

“…End-group of collagens, pro collagen , and gelatin.-Collagen, procollagen, and gelatin have also been analyzed by several groups of workers (107,108,109,152,153). The more soluble fraction, procollagen, has apparently a very small number of N-terminal groups, and typical collagen has none unless it is degraded prior to analysis.…”