Unusual Composition of Peptidoglycan in Bordetella pertussis

Tuomanen, Elaine; Schwartz, Jill L.; Sande, Stephen; Light, K.J.; Gage, Douglas A.

doi:10.1016/s0021-9258(18)60432-6

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“…En el anexo a este capítulo se presentan ejemplos de bacterias individuales donde se muestra la variación de los valores de rigidez medidos a cada hora durante las 5 horas de exposición a antibióticos (Anexo: Figura 4). III.4.3 Análisis del efecto de antibióticos sobre la rigidez de bacterias en procesos de división Teniendo en cuenta que B. pertussis crece con un tiempo de generación inusualmente largo del orden de 8 h (Tuomanen et al, 1989) y que los antibióticos analizados actúan sobre la capa de mureína y en la síntesis de nuevos polipéptidos requeridos para terminar la elongación celular previa a la separación y en consecuencia evitando la división celular, se llevó a cabo un análisis de la rigidez de B. pertussis durante el proceso de división y exposición a antibióticos. En bacterias incubadas en medio SS sin la presencia de antibióticos, se observa la definición de la zona de división mediante un ablandamiento de la misma y un incremento del Módulo de Young en ambas células una vez completado el proceso (Figura 6).…”

Section: Resultsunclassified

Estudios a micro y nanoescala de la respuesta de <i>Bordetella pertussis</i> a condiciones del entorno

Villalba¹

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Bordetella pertussis es una bacteria gram negativa agente causal de la tos convulsa o coqueluche. A pesar de los altas tasa de vacunación, esta enfermedad es considerada como resurgente. En esta tesis doctoral se pretendió avanzar en el conocimiento de la capacidad de B. pertussis para responder a diversas condiciones de estrés ambiental. El trabajo se centró sobre el efecto de agentes antimicrobianos, la modulación de la virulencia bacteriana y la presencia de fuerzas de shear hidromecánico. En primer lugar, mediante la utilización de Microscopia de Fuerza Atómica (AFM: Atomic Force Microscopy) se exploraron las propiedades nanomecánicas de la superficie celular de B. pertussis en fase virulenta y avirulenta, así como su transición en ambientes moduladores de virulencia. Adicionalmente, se analizó el impacto de antibióticos sobre dichas propiedades nanomecánicas. A continuación, se implementó la utilización de un equipo nanosensor de movimientos derivado de AFM. De este modo, oscilaciones nanomecánicas generadas por esta bacteria fueran correlacionadas con el estado de virulencia y la respuesta a antibióticos utilizados en la práctica clínica. Los métodos convencionales de estudios sobre sensibilidad a antibióticos de B. pertussis requieren mucho tiempo y son costosos, mientras que el uso de dicho biosensor nanomecánico mostró resultados en tiempo real con alta sensibilidad. Finalmente, en este trabajo de tesis doctoral se estudió el efecto del shear hidromecánico sobre B. pertussis durante la adhesión a una superficie abiótica y formación de biofilm.

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Section: Resultsunclassified

Estudios a micro y nanoescala de la respuesta de <i>Bordetella pertussis</i> a condiciones del entorno

Villalba¹

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Negative and positive ion matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry and positive ion nano‐electrospray ionization quadrupole ion trap mass spectrometry of peptidoglycan fragments isolated from various Bacillus species

et al. 2001

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A general approach for the detailed characterization of sodium borohydride-reduced peptidoglycan fragments (syn. muropeptides), produced by muramidase digestion of the purified sacculus isolated from Bacillus subtilis (vegetative cell form of the wild type and a dacA mutant) and Bacillus megaterium (endospore form), is outlined based on UV matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) and nano-electrospray ionization (nESI) quadrupole ion trap (QIT) mass spectrometry (MS). After enzymatic digestion and reduction of the resulting muropeptides, the complex glycopeptide mixture was separated and fractionated by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Prior to mass spectrometric analysis, the muropeptide samples were subjected to a desalting step and an aliquot was taken for amino acid analysis. Initial molecular mass determination of these peptidoglycan fragments (ranging from monomeric to tetrameric muropeptides) was performed by positive and negative ion MALDI-MS using the thin-layer technique with the matrix alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid. The results demonstrated that for the fast molecular mass determination of large sample numbers in the 0.8-10 pmol range and with a mass accuracy of +/-0.07%, negative ion MALDI-MS in the linear TOF mode is the method of choice. After this kind of muropeptide screening often a detailed primary structural analysis is required owing to ambiguous data. Structural data could be obtained from peptidoglycan monomers by post-source decay (PSD) fragment ion analysis, but not from dimers or higher oligomers and not with the necessary sensitivity. Multistage collision-induced dissociation (CID) experiments performed on an nESI-QIT instrument were found to be the superior method for structural characterization of not only monomeric but also of dimeric and trimeric muropeptides. Up to MS4 experiments were sometimes necessary to obtain unambiguous structural information. Three examples are presented: (a) CID MSn (n = 2-4) of a peptidoglycan monomer (disaccharide-tripeptide) isolated from B. subtilis (wild type, vegetative cell form), (b) CID MSn (n = 2-4) of a peptidoglycan dimer (bis-disaccharide-tetrapentapeptide) obtained from a B. subtilis mutant (vegetative cell form) and (c) CID MS2 of a peptidoglycan trimer (a linear hexasaccharide with two peptide side chains) isolated from the spore cortex of B. megaterium. All MS(n) experiments were performed on singly charged precursor ions and the MS2 spectra were dominated by fragments derived from interglycosidic bond cleavages. MS3 and MS4 spectra exhibited mainly peptide moiety fragment ions. In case of the bis-disaccharide-tetrapentapeptide, the peptide branching point could be determined based on MS3 and MS4 spectra. The results demonstrate the utility of nESI-QIT-MS towards the facile determination of the glycan sequence, the peptide linkage and the peptide sequence and branching of purified muropeptides (monomeric up to trimeric forms). The wealth of structural information generated by nESI-QIT...

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MS/MS applications in biological problems

Favretto¹,

Traldi²

1993

Mass Spectrometry Reviews

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Unusual Composition of Peptidoglycan in Bordetella pertussis

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Estudios a micro y nanoescala de la respuesta de <i>Bordetella pertussis</i> a condiciones del entorno

Estudios a micro y nanoescala de la respuesta de <i>Bordetella pertussis</i> a condiciones del entorno

Negative and positive ion matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry and positive ion nano‐electrospray ionization quadrupole ion trap mass spectrometry of peptidoglycan fragments isolated from various Bacillus species

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