Vibralacton als Sonde zur Aufklärung der Aktivität und Struktur des ClpP1P2‐Komplexes aus Listeria monocytogenes

Abstract

den Naturstoffen findet sich eine Vielzahl biologisch aktiver Verbindungen mit elektrophilem Grundgerüst, die spezifisch mit nukleophilen Resten, wie Cystein und Serin, im aktiven Zentrum der entsprechenden Enzyme reagieren. [1][2][3] Die Reste sind hauptsächlich für die Katalyse von Reaktionen wichtig und bieten eine maßgeschneiderte Reaktivität gegenüber geeigneten Substraten.[4] Wir und andere erforschten bisher die Angriffsziele von monocyclischen bLactonen, die sich als potente und selektive Inhibitoren diverser krankheitsrelevanter Enzymklassen herausstellten. [2,3,[5][6][7][8] Im Falle der kovalenten Bindung und Inhibition der caseinolytischen Peptidase ClpP wurde eine drastische Verminderung der Virulenz von Bakterien festgestellt.[3] ClpP ist ein zentrales, hoch konserviertes Hitzeschockprotein mit zusätzlichen regulatorischen Funktionen in vielen pathogenen Bakterien. [9][10][11] Einige Organismen, wie Listeria monocytogenes, kodieren in ihrem Genom zwei ClpP-Isoformen (ClpP1 und ClpP2), deren Funktion und Struktur noch nicht charakterisiert wurden. Bisher wurde ausschließlich ClpP2 als Angriffsziel der b-Lactone beschrieben.[2] Es ist daher mçg-lich, dass es monocyclischen b-Lactonen an entsprechender Reaktivität fehlt, um mit dem nukleophilen aktiven Zentrum von ClpP1 zu reagieren. In unseren hier vorgestellten Studien haben wir den Rahmen der von Naturstoffen inspirierten b-Lactone zu einem gespannten bicyclischen Ringsystem erweitert, das eine hçhere Reaktivität aufweisen kçnnte. Die Naturstoffe Omuralid, Salinosporamid und Vibralacton (VL) stellen solch ein Strukturgerüst dar und wurden bisher als Proteasom-oder Lipase-Inhibitoren beschrieben. [12][13][14] Wir nutzen hier eine kombinierte Strategie aus Proteomik und biologischer Chemie, genannt "aktivitätsbasiertes Protein-Profiling (ABPP)", [15][16][17] um nachzuweisen, dass VL, im Unterschied zu monocyclischen b-Lactonen, zu beiden ClpP-Isoformen (ClpP1 und ClpP2) in L. monocytogenes eine Affinität aufweist. Außerdem war es in Kombination mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Homologie-Modellierung und Strukturvorhersage mçglich, die quartäre Struktur des heterooligomeren Komplexes aufzuklären (Abbildung 1).VL wurde nach Zhou und Snider [18] synthetisiert (Schema 1 der Hintergrundinformationen) und im letzten Schritt mit einem Alkinmarker, der die Identifizierung der Angriffsziele durch ABPP ermçglicht, zur Sonde modifiziert (Abbildung 1).[19] Dabei wurden zunächst lebende Zellen von L. welshimeri und dessen pathogenem Pendant L. monocytogenes mit der Vibralactonsonde (VLP) inkubiert. Nach Zellaufschluss wurde das erhaltene Proteom über "ClickChemie" (CC) [20][21][22] mit Rhodaminazid behandelt, und die markierten Ziele der Sonde wurden auf einem Fluoreszenzgel (SDS-PAGE) visualisiert (Abbildung 1 der Hintergrundinformationen). Zwei stark fluoreszierende, gleich intensive Banden etwa 20 kDa schwerer Proteine konnten in L. welshimeri sowie auch in L. monocytogenes (Abbildung 2 A) bis zu einer VLP-Konzentration von 3.4 mm (Abbildung 1 C der...

Elucidating the Biosynthetic Pathway for Vibralactone: A Pancreatic Lipase Inhibitor with a Fused Bicyclic β‐Lactone

“…This observation was well corroborated by the feeding of [U- 13 3 OH+H] + , all corresponding to the same retention time (see SI-7b in the Supporting Information). To test this hypothesis, [U-13 C]dl-phenylalanine (Phe) was fed and assimilated consequently to produce 2 b showing strong abundance (16-18 %; see SI-6 in the Supporting Information) and coupling at C1/ C2/C3/C4/C5/C6/C7 (J 1-2 = 29.3 Hz, J 2-3 = 41.9 Hz, J 4-3 = 42.5 Hz, J 4-5 = 38.5 Hz, J 5-1 = 29.3 Hz, J 6-1 = 45.2 Hz, J 7-3 = 48.5 Hz), and very weak (ca.…”

“…[1] Inspired by its clinical potential for the treatment of obesity, Zhou and Snider developed an elegant 10-step chemical route to the total synthesis of (AE)-vibralactone and extended the work to (À)-vibralactone and (À)-vibralactone C. [2] Recent investigations established that the unusual fused b-lactone bicycle system of vibralactone may account for binding of both types of caseinolytic peptidases vital for bacterial virulence. [3] While vibralactone seems structurally simple for its small size, contradicting biosynthetic origins, including sesquiterpenoid and polyketide, of this bicyclic blactone have been proposed. [4] Furthermore, very little has been done on the biosynthetic mechanisms for natural products isolated from basidiomycete fungi in general.…”

Elucidating the Biosynthetic Pathway for Vibralactone: A Pancreatic Lipase Inhibitor with a Fused Bicyclic β‐Lactone

“…Using 6 as a reference, we searched through all the time-course cultures under LC/MS but failed to detect the intermediate 6. The reason for this is probably owing to the transient nature of 6 on the metabolic pathway of + at m/z 241 for 1, and [M+CH 3 OH+H] + at m/z 257 for 2. Figure 2.…”

“…[1] Inspired by its clinical potential for the treatment of obesity, Zhou and Snider developed an elegant 10-step chemical route to the total synthesis of (AE)-vibralactone and extended the work to (À)-vibralactone and (À)-vibralactone C. [2] Recent investigations established that the unusual fused b-lactone bicycle system of vibralactone may account for binding of both types of caseinolytic peptidases vital for bacterial virulence. [3] While vibralactone seems structurally simple for its small size, contradicting biosynthetic origins, including sesquiterpenoid and polyketide, of this bicyclic blactone have been proposed. [4] Furthermore, very little has been done on the biosynthetic mechanisms for natural products isolated from basidiomycete fungi in general.…”

Naturstoffe und ihre zellulären Angriffsziele

“…Eine komplementär wirkende Klasse von Verbindungen adressiert ebenfalls ClpP — bewirkt aber genau den gegenteiligen Effekt. Diese zum Teil synthetischen Verbindungen aus der Klasse der β‐Lactone (inspiriert von Naturstoffen wie Vibralacton (4) )4 binden im aktiven Zentrum des Enzyms und blockieren somit dessen Aktivität. Bei pathogenen Erregern wie Staphylococcus aureus und Listeria monocytogens verringert die Inhibierung von ClpP die Virulenz, also die Fähigkeit der Erreger, eine Infektion auszulösen.…”