Vollständige Umkehrung der Enantioselektivität gegen acetylierte tertiäre Alkohole durch eine Doppelmutation in einer Esterase aus Bacillus subtilis

Abstract

Zur Synthese enantiomerenreiner Verbindungen werden häufig Biokatalysatoren eingesetzt, da diese wegen ihrer hohen Chemo-, Regio-und Stereoselektivität der chemischen Katalyse oft überlegen sind; [1] allerdings zeigen die Wildtypen (WTs) der Enzyme oft keine breite Substratspezifität in Kombination mit einer ausreichend hohen Selektivität. Diese Einschränkungen können durch rationales Proteindesign oder gerichtete Evolution beseitigt werden. Oft ließ sich die Enantioselektivität durch diese Methoden steigern, eine Umkehrung der Enantioselektivität gelang aber nur in Ausnahmefällen.[2] Interessant für die Synthese sind nur E-Werte > 50 -eine Schwelle, die nur schwer zu überwinden ist, wenn man von einem Enzym mit entgegengesetzter Enantioselektivität ausgeht. Beispielsweise änderten May et al. eine d-selektive Hydantoinase in eine l-selektive Variante, mit der allerdings nur 20 % ee erreicht werden konnten, [2d] und Zha et al.[2e] invertierten die Enantioselektivität einer Lipase aus Ps. aeruginosa bis zu E = 30. Zudem können die Varianten deutlich an katalytischer Aktivität einbüßen, wie dies für eine Arylmalonat-Decarboxylase mit invertierter Enantioselektivität beschrieben wurde.[3] Daher zählt die Umkehrung der Enantiopräferenz immer noch zu den anspruchsvollsten Aufgaben des Proteindesigns.Eine Esterase von Bacillus subtilis (BS2) wurde den GGG(A)X-Hydrolasen zugeordnet [4] und zeigt dementsprechend Aktivität gegenüber Estern tertiärer Alkohole. Esterasen, die das häufigere GX-Motiv in der Oxyaniontasche enthalten, sind hingegen wegen ihres kleineren aktiven Zentrums nicht gegen diese sterisch recht anspruchsvollen Ester aktiv. Mit den Mutanten G105A und E188D wurden zwei Varianten mit exzellenter R-Enantioselektivität (E > 100) gegen den Ester 1 hergestellt, während der Wildtyp eine Enantioselektivität von E R = 42 aufweist.[5] Optisch aktive tertiäre Alkohole sind wichtige Bausteine für die organische Synthese [6] und wurden kürzlich zur Herstellung eines oral aktiven A 2A -Rezeptorantagonisten in einem Maus-Katalepsiemodell verwendet.[7] Darüber hinaus sind fluorierte optisch aktive Alkohole von großem Interesse, da sie in ferroelektrischen Flüssigkristallen und Wirkstoffen Verwendung finden können. [8] Auf der Basis einer vorangegangenen Studie zum rationalen Proteindesign [5a] berichten wir hier über die Strategie einer fokussierten gerichteten Evolution zur Inversion der Enantioselektivität der Esterase BS2 gegen acetylierte tertiäre Alkohole (Schema 1).Durch Computer-Modeling identifizierten wir kürzlich [5a] den Rest E188, der einen starken Einfluss auf die Enantioselektivität der Esterase BS2 gegen acetylierte tertiäre Alkohole ausübt: Während die Mutante E188D einen E-Wert von E R > 100 für 1 aufwies, zeigte die Mutante E188F eine umgekehrte Enantiopräferenz (E S = 3). Diese Beobachtung veranlasste uns, eine fokussierte gerichtete Evolution, basierend auf Sättigungsmutagenese in Anlehnung an die von Reetz und Mitarbeitern entwickelte CASTing-Methode, [9] durchzuführen. Anhand der Kristallstrukt...

Directed Evolution of an Enantioselective Enoate‐Reductase: Testing the Utility of Iterative Saturation Mutagenesis

“…Since we wanted to test the utility of ISM, [11][12][13]15] the question of quality control in the present context was addressed. It can be argued that in general at least 10% of the created clones should be sequenced for a meaningful statistical analysis.…”

“…[14] Iterative CASTing was first shown to be unusually effective in the enhancement of enantioselectivity of an epoxide hydrolase, [11] and was subsequently applied successfully to other enzymes. [15] However, claiming wide applicability requires further research, especially since different ways to apply the iterative process exist.…”

Bacillus subtilis Esterase (BS2) and its Double Mutant Have Different Selectivity in the Removal of Carboxyl Protecting Groups

“…In the case of BS2 WT, attack at the g-n-propyl ester was favored and the aromatic ring pointed out of the active site, while in the case of the double mutant, the aromatic ring was located deep inside the active site next to the M193C mutation which facilitated an attack at the a-ethyl ester (Figure 3 a/b). By the M193C mutation a previously described channel [13] is [a] Yield of isolated product.…”

“…Figure 2 shows the curves for the hydrolysis of the Z-GABA esters by the double mutant E188W/M193C using similar units compared with the WT since the double mutant shows only 14% of the specific WT activity (towards pNPA). [13] The n-butyl ester 1c was quickly hydrolyzed quantitatively in less than 20 min. However, there was no considerable difference between the rates of hydrolysis of n-propyl and ethyl esters 1b and 1a.…”

“…[12] Most interestingly, the double mutant E188W/M193C of BS2 presented complete inversion of enantioselectivity towards acetylated tertiary alcohols. [13] Such a modification in enantioselectivity might suggest altered selectivity for the removal of carboxyl protecting groups by the mutant. Thus, the aim of the present work was to identify the carboxyl protecting groups that may be removed efficiently by BS2 and its mutant E188W/ M193C and to study the selectivity of these two enzymes for the removal of esters.…”