Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης και των γονιδιακών οδών με cDNA μικροσυστοιχίες κατά τη διάγνωση και τη χημειοθεραπεία στην παιδική οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία

Abstract

Εισαγωγή: Η Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία (ΟΛΛ) της παιδικής ηλικίας παρουσιάζει αυξανόμενο ποσοστό επιβίωσης τα τελευταία χρόνια. Ωστόσο οι μέθοδοι κατάταξης ως προς τους παράγοντες κινδύνου της νόσου που χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα, δικαιολογούν μικρό ποσοστό από τους ασθενείς που τελικά υποτροπιάζουν. Γίνεται προσπάθεια στην καλύτερη αξιοποίηση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων που ήδη υπάρχουν, με περαιτέρω μελέτη του τρόπου δράσης τους. Σκοπός: Να δημιουργηθεί ένα κυτταρικό σύστημα μελέτης στο οποίο να μελετηθεί η επίδραση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία της ΟΛΛ στην παιδική ηλικία. Να μελετηθεί ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αυτών, η απόπτωση και η νέκρωσή τους κάτω από την επίδραση των φαρμάκων. Να μελετηθεί η έκφραση των γονιδίων κατά την επώαση με τα φάρμακα και να εντοπισθούν μεταβολές που οφείλονται στη φύση των κυττάρων, στη φύση του κάθε φαρμάκου και τη δόση που χρησιμοποιήθηκε και να βρεθούν πιθανοί προγνωστικοί και θεραπευτικοί στόχοι. Υλικό και μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν οι κυτταρικές σειρές CCRF-CEM (Τ-λευχαιμικά κύτταρα) και CCRF-SB (Β-λευχαιμικά κύτταρα). Τα κύτταρα επωάσθηκαν με τα φάρμακα Prednisolone, Vincristine, LAsparaginase, Daunomycin/Doxorubicin, Aracytine, Cyclophosphamide, Methotrexate. Ελέγχθηκε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, ο κυτταρικός κύκλος, ο κυτταρικός θάνατος των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Η διαφορική έκφραση των γονιδίων μελετήθηκε με cDNA μικροσυστοιχίες. Αποτελέσματα: Η Prednisolone έδειξε διφασική δράση στην επίδρασή της στα κύτταρα CCRF-CEM, με μιτογενή δραστηριότητα στις μικρές συγκεντρώσεις και επαγωγή της νέκρωσης στις υψηλές δόσεις. Οι κυτταρικές σειρές ήταν ανθεκτικές στα γλυκοκορτικοειδή. Τα διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια ήταν RTN4R, NEFL, CHEK1, SYCE1L, ITIH3, B3GAT3, TTC3, RTN4R, CYP1A1 και HOXA13, που σχετίζονται με λειτουργίες νευρικής διαφοροποίησης και ρύθμισης της δημιουργίας των αξονίων των νευρώνων, λειτουργίες σχετικές με τον κυτταρικό κύκλο, το μεταβολισμό των γλυκοσαμινών/γλυκανών, την αρνητική ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, και την ενεργοποίηση του καταβολισμού και ανακύκλωσης πρωτεϊνών μέσω του ενδοπλασματικού συμπλέγματος. Στη σύγκριση των δύο κυτταρικών σειρών που επωάσθηκαν με prednisolone βρέθηκαν τα γονίδια FICD, PREX1, LIAS και TPK1 που συμμετέχουν στη ρύθμιση της σηματοδοτικής οδού των Rho πρωτεϊνών και την ρύθμιση βιοσυνθετικών συν-ενζύμων. Τα κύτταρα CCRF-CEM ήταν ευαίσθητα στη Vincristine. Τα διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια ήταν τα NEFL, SHARPIN, RTN4R, UBB, HTT, MBP και ACSBG1, που συμμετέχουν στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου και σε λειτουργίες νευρωνικής ανάπτυξης. Η Doxorubicin/Daunomycin επέφερε πλήρη αναστολή του πολλαπλασιασμού στα κύτταρα CCRF-CEM. Στη μελέτη με τις μικροσυστοιχίες βρέθηκαν γονίδια, τα SLC12A8, SEC61G, SLC26A4, TRPM5Τ, NEFL TIAM2, FANCA και LFNG τα οποία συμμετέχουν σε μηχανισμούς διαμεμβρανικής μεταφοράς, στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου και τη ρύθμιση της Μ φάσης στον μειωτικό κυτταρικό κύκλο. Τα κύτταρα CCRF-CEM ήταν ευαίσθητα στην Aracytine. Οι μικροσυστοιχίες έδειξαν διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια τα οποία δρουν δοσοεξαρτώμενα και αφορούν στη δράση της Aracytine. Αυτά τα γονίδια ήταν τα FICD, TIAM2, NDUFS1 και ATB2B4 που συσχετίζονται με τη ρύθμιση της σηματοδοτικής οδού των Rho πρωτεϊνών και συμμετέχουν στη βιοσυνθετική και μεταβολική οδό των νουκλεοτιδίων όπως και τα MYT1L, IRX6 και TBX1 που συμμετέχουν στη ρύθμιση του μεταβολισμού του RNA. Τα κύτταρα CCRF-CEM έδειξαν ανθεκτικότητα στη Methotrexate. Στη μελέτη της methotrexate με μικροσυστοιχίες παρουσιάστηκαν γονίδια που μεταβάλεται η έκφρασή τους. Τα γονίδια αυτά ήταν τα KLK6, MBP, RTN4R, NEFL, CHEK1 και CAMK2G, που συμμετέχουν σε λειτουργίες ρύθμισης του κεντρικού νευρικού συστήματος, διεργασίες του ΚΝΣ και τη φωσφορυλίωση πρωτεϊνών. Κοινά γονίδια στη σύγκριση των σειρών CCRF-CEM και CCRF-SB μετά από επώαση με AraC, ήταν τα γονίδια SOS2, FICD, TIAM2, PREX, SPATA13, ADAM9 και ADORA1, που σχετίζονται με τη ρύθμιση των Rho πρωτεϊνών και τη σηματοδοτική οδό MAPK. Για την επώαση με τις ανθρακυκλίνες τα γονίδια που εμφανίσθηκαν εκφράζουν πρωτεΐνες που έχουν σχέση με μεταγραφικούς παράγοντες ή είναι μεταγραφικοί παράγοντες, όπως τα ATF6, IKZF2, PRKDC, HDAC2 και TFEB. Για την περίπτωση της Methotrexate, τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικώς σχετίζονται επίσης με τη σηματοδοτική οδό MAPK. Στη vincristine ξεχωρίζουν λειτουργίες που σχετίζονται με τον κυτταρικό θάνατο, με τους διαύλους ασβεστίου και την νευρωνική μορφογένεση. Συμπέρασμα: Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία της παιδικής ΟΛΛ μελετήθηκαν για τη δράση τους. Προέκυψαν στοιχεία για την κυτταροτοξικότητά τους και για την επίδρασή τους σε συγκεκριμένα γονίδια. Η ενεργοποίηση ή αδρανοποίηση των γονιδίων αυτών υποδεικνύει μηχανισμούς και λειτουργίες που συμμετέχουν στην αντίδραση των λευχαιμικών κυττάρων στα φάρμακα, την ευαισθησία ή την αντοχή τους. Τα γονίδια αυτά θα μπορούσαν να αποτελέσουν προγνωστικούς παράγοντες ή θεραπευτικούς στόχους. Τέλος, η εφαρμογή του μοντέλου που δημιουργήθηκε θα μπορούσε να δώσει στοιχεία για την ευαισθησία ασθενών σε φάρμακα και να τροποποιήσει έτσι το θεραπευτικό σχήμα, αυξάνοντας τις πιθανότητες επιτυχούς θεραπείας με τις λιγότερες παρενέργειες και πιθανότητες υποτροπής.

Μελέτη της έκφρασης των κοινών οδών των γονιδίων in vitro και in vivo στους όγκους του κεντρικού νευρικού συστήματος για την ανεύρεση αιματολογικών δεικτών

“…Παράλληλα, και μετά από μελέτες στην εταιρεία Affymetrix (Affymetrix, Inc., USA), η επιτόπια, υψηλής πυκνότητας, σύνθεση ολιγονουκλεοτιδίων πάνω σε υαλώδες υπόστρωμα αποδείχθηκε ότι δύναται να παρέχει αξιόπιστες μετρήσεις της γονιδιακής έκφρασης(Fodor, Read et al 1991;Lockhart, Dong et al 1996). Η τεχνολογία αυτή έθεσε τις βάσεις για την ανάπτυξη των σημερινών υπέρ-υψηλής πυκνότητας μικροσυστοιχιών DNA.Οι μικροσυστοιχίες DNA εφαρμόστηκαν πρώτη φορά για ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε επίπεδο γονιδιώματος οργανισμού το 1997(DeRisi, Iyer et al 1997;Κουλτούκη 2011).ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗΣ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΩΝΣε γενικές γραμμές, μια μικροσυστοιχία DNA είναι μια συστοιχία από -συγκεκριμένης διάταξηςακινητοποιημένα νουκλεϊκά οξέα, γνωστά ως ανιχνευτές (probes) ή -με την ορολογία του προτύπου MIAME -ως αναφορές 4 (reporters), τα οποία έχουν κατασκευασθεί είτε με εναπόθεση είτε επιτόπια πάνω σε ένα επίπεδο, στερεό υπόστρωμα, συνήθως από γυαλί ή πυρίτιο. Οι ακριβείς θέσεις των αναφορών πάνω στη μικροσυστοιχία αναφέρονται -κατά MIAME -ως χαρακτηριστικά (features).Η μικροσυστοιχία χρησιμοποιείται συνήθως για να τη μέτρηση της ποσότητας mRNA που βρίσκεται στο υπό μελέτη βιολογικό δείγμα μέσω ενός πειράματος υβριδοποίησης(Scherer, Gwinner et al 2009).…”

“…χώρο της ιατρικής ειδικότερα, μπορούν να διακριθούν τρείς βασικές κατηγορίες εφαρμογών των μικροσυστοιχιών DNA, σύμφωνα με τον Tarca και συνεργάτες (2002): (α) η σύγκριση τάξεων (class comparison), η οποία αφορά στην εύρεση διαφορών στα επίπεδα έκφρασης ανάμεσα σε δύο ή περισσότερα δείγματα, (β) η πρόβλεψη τάξεων (class prediction), που αφορά στην εύρεση της τάξης στην οποία ανήκει ένα δείγμα, με βάση το προφίλ της γονιδιακής του έκφρασης, και (γ) η ανακάλυψη τάξεων (class discovery), όπου ένα σύνολο από προφίλ γονιδιακής έκφρασης αναλύεται με σκοπό την ανακάλυψη υποσυνόλων με κοινά χαρακτηριστικά(Tarca, Romero et al 2006). Για παράδειγμα, τα δεδομένα μικροσυστοιχιών DNA δύναται να πληροφορήσουν για το στάδιο μιας νόσου, ιδιαίτερα στον τομέα της ογκολογίας, όπου η έγκυρη και έγκαιρη διάγνωση παίζει καθοριστικό ρόλο.Επιπροσθέτως, οι μικροσυστοιχίες DNA δύναται όχι μόνο να χρησιμοποιηθούν για τη διαφορική διάγνωση των καρκινικών όγκων, και τον καθορισμό νέων τύπων καρκινικών όγκων που είναι αδύνατο να διακριθούν ιστολογικά, αλλά και να πληροφορήσουν για το προγνωστικό αποτέλεσμα(Causton and Game 2003;Κουλτούκη 2011). έγινε φανερό από τα παραπάνω, οι μικροσυστοιχίες DNA έχουν ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών σε διάφορα επιστημονικά πεδία, το οποίο δεν εξαντλείται στο παρόν εδάφιο.…”