It has been shown previously that glucocorticoids exert a dual mechanism of action, meaning cytotoxic and mitogenic as well as mitogenic and anti-apoptotic, in a dosedependent manner on CCRF-CEM cells at 72h. Early gene expression response suggested also a dose-dependent dual mechanism of action of prednisolone which is apparently reflected on cell state upon 72 h of treatment. The present work applies different computational methods on microarray data in order to examine the hypothesis whether these cells have an intrinsic or acquired mechanism of resistance. Early onset gene expression at 4h was compared to 72h gene expression. Early gene expression allowed identification of genes initiating pivotal, early onset regulatory mechanisms activated by prednisolone. Late, 72h exposure, microarray analysis allowed the relative identification of feedback mechanisms. From these results, it appears that CCRF-CEM cells used in this study exhibited a combined pattern of intrinsic and acquired resistance to prednisolone.

No abstract

Εισαγωγή: Η Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία (ΟΛΛ) της παιδικής ηλικίας παρουσιάζει αυξανόμενο ποσοστό επιβίωσης τα τελευταία χρόνια. Ωστόσο οι μέθοδοι κατάταξης ως προς τους παράγοντες κινδύνου της νόσου που χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα, δικαιολογούν μικρό ποσοστό από τους ασθενείς που τελικά υποτροπιάζουν. Γίνεται προσπάθεια στην καλύτερη αξιοποίηση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων που ήδη υπάρχουν, με περαιτέρω μελέτη του τρόπου δράσης τους. Σκοπός: Να δημιουργηθεί ένα κυτταρικό σύστημα μελέτης στο οποίο να μελετηθεί η επίδραση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία της ΟΛΛ στην παιδική ηλικία. Να μελετηθεί ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αυτών, η απόπτωση και η νέκρωσή τους κάτω από την επίδραση των φαρμάκων. Να μελετηθεί η έκφραση των γονιδίων κατά την επώαση με τα φάρμακα και να εντοπισθούν μεταβολές που οφείλονται στη φύση των κυττάρων, στη φύση του κάθε φαρμάκου και τη δόση που χρησιμοποιήθηκε και να βρεθούν πιθανοί προγνωστικοί και θεραπευτικοί στόχοι. Υλικό και μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν οι κυτταρικές σειρές CCRF-CEM (Τ-λευχαιμικά κύτταρα) και CCRF-SB (Β-λευχαιμικά κύτταρα). Τα κύτταρα επωάσθηκαν με τα φάρμακα Prednisolone, Vincristine, LAsparaginase, Daunomycin/Doxorubicin, Aracytine, Cyclophosphamide, Methotrexate. Ελέγχθηκε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, ο κυτταρικός κύκλος, ο κυτταρικός θάνατος των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Η διαφορική έκφραση των γονιδίων μελετήθηκε με cDNA μικροσυστοιχίες. Αποτελέσματα: Η Prednisolone έδειξε διφασική δράση στην επίδρασή της στα κύτταρα CCRF-CEM, με μιτογενή δραστηριότητα στις μικρές συγκεντρώσεις και επαγωγή της νέκρωσης στις υψηλές δόσεις. Οι κυτταρικές σειρές ήταν ανθεκτικές στα γλυκοκορτικοειδή. Τα διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια ήταν RTN4R, NEFL, CHEK1, SYCE1L, ITIH3, B3GAT3, TTC3, RTN4R, CYP1A1 και HOXA13, που σχετίζονται με λειτουργίες νευρικής διαφοροποίησης και ρύθμισης της δημιουργίας των αξονίων των νευρώνων, λειτουργίες σχετικές με τον κυτταρικό κύκλο, το μεταβολισμό των γλυκοσαμινών/γλυκανών, την αρνητική ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, και την ενεργοποίηση του καταβολισμού και ανακύκλωσης πρωτεϊνών μέσω του ενδοπλασματικού συμπλέγματος. Στη σύγκριση των δύο κυτταρικών σειρών που επωάσθηκαν με prednisolone βρέθηκαν τα γονίδια FICD, PREX1, LIAS και TPK1 που συμμετέχουν στη ρύθμιση της σηματοδοτικής οδού των Rho πρωτεϊνών και την ρύθμιση βιοσυνθετικών συν-ενζύμων. Τα κύτταρα CCRF-CEM ήταν ευαίσθητα στη Vincristine. Τα διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια ήταν τα NEFL, SHARPIN, RTN4R, UBB, HTT, MBP και ACSBG1, που συμμετέχουν στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου και σε λειτουργίες νευρωνικής ανάπτυξης. Η Doxorubicin/Daunomycin επέφερε πλήρη αναστολή του πολλαπλασιασμού στα κύτταρα CCRF-CEM. Στη μελέτη με τις μικροσυστοιχίες βρέθηκαν γονίδια, τα SLC12A8, SEC61G, SLC26A4, TRPM5Τ, NEFL TIAM2, FANCA και LFNG τα οποία συμμετέχουν σε μηχανισμούς διαμεμβρανικής μεταφοράς, στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου και τη ρύθμιση της Μ φάσης στον μειωτικό κυτταρικό κύκλο. Τα κύτταρα CCRF-CEM ήταν ευαίσθητα στην Aracytine. Οι μικροσυστοιχίες έδειξαν διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια τα οποία δρουν δοσοεξαρτώμενα και αφορούν στη δράση της Aracytine. Αυτά τα γονίδια ήταν τα FICD, TIAM2, NDUFS1 και ATB2B4 που συσχετίζονται με τη ρύθμιση της σηματοδοτικής οδού των Rho πρωτεϊνών και συμμετέχουν στη βιοσυνθετική και μεταβολική οδό των νουκλεοτιδίων όπως και τα MYT1L, IRX6 και TBX1 που συμμετέχουν στη ρύθμιση του μεταβολισμού του RNA. Τα κύτταρα CCRF-CEM έδειξαν ανθεκτικότητα στη Methotrexate. Στη μελέτη της methotrexate με μικροσυστοιχίες παρουσιάστηκαν γονίδια που μεταβάλεται η έκφρασή τους. Τα γονίδια αυτά ήταν τα KLK6, MBP, RTN4R, NEFL, CHEK1 και CAMK2G, που συμμετέχουν σε λειτουργίες ρύθμισης του κεντρικού νευρικού συστήματος, διεργασίες του ΚΝΣ και τη φωσφορυλίωση πρωτεϊνών. Κοινά γονίδια στη σύγκριση των σειρών CCRF-CEM και CCRF-SB μετά από επώαση με AraC, ήταν τα γονίδια SOS2, FICD, TIAM2, PREX, SPATA13, ADAM9 και ADORA1, που σχετίζονται με τη ρύθμιση των Rho πρωτεϊνών και τη σηματοδοτική οδό MAPK. Για την επώαση με τις ανθρακυκλίνες τα γονίδια που εμφανίσθηκαν εκφράζουν πρωτεΐνες που έχουν σχέση με μεταγραφικούς παράγοντες ή είναι μεταγραφικοί παράγοντες, όπως τα ATF6, IKZF2, PRKDC, HDAC2 και TFEB. Για την περίπτωση της Methotrexate, τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικώς σχετίζονται επίσης με τη σηματοδοτική οδό MAPK. Στη vincristine ξεχωρίζουν λειτουργίες που σχετίζονται με τον κυτταρικό θάνατο, με τους διαύλους ασβεστίου και την νευρωνική μορφογένεση. Συμπέρασμα: Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία της παιδικής ΟΛΛ μελετήθηκαν για τη δράση τους. Προέκυψαν στοιχεία για την κυτταροτοξικότητά τους και για την επίδρασή τους σε συγκεκριμένα γονίδια. Η ενεργοποίηση ή αδρανοποίηση των γονιδίων αυτών υποδεικνύει μηχανισμούς και λειτουργίες που συμμετέχουν στην αντίδραση των λευχαιμικών κυττάρων στα φάρμακα, την ευαισθησία ή την αντοχή τους. Τα γονίδια αυτά θα μπορούσαν να αποτελέσουν προγνωστικούς παράγοντες ή θεραπευτικούς στόχους. Τέλος, η εφαρμογή του μοντέλου που δημιουργήθηκε θα μπορούσε να δώσει στοιχεία για την ευαισθησία ασθενών σε φάρμακα και να τροποποιήσει έτσι το θεραπευτικό σχήμα, αυξάνοντας τις πιθανότητες επιτυχούς θεραπείας με τις λιγότερες παρενέργειες και πιθανότητες υποτροπής.