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EEntre os membros da ordem Characiformes, a família Characidae é uma das mais complexas, sendo composta de um grande número de espécies. Uma das subunidades desta família é a subfamília Characinae, composta por doze gêneros e 73 espécies, conhecidos popularmente como peixes-cigarras, peixes-cachorra, dentudos entre outros, sendo de distribuição amplamente pela região Neotropical. Estudos citogenéticos em alguns integrantes da subfamília Characinae (Cynopotamus kincaidi, Roeboides bonariensis, e Galeocharax humeralis) indicam um 2n=52 com predomínio de um sistema de NORs simples. Com o objetivo de ampliar os dados citogenéticos para esta subfamília foram analisados exemplares de Galeocharax humeralis e Cynopotamus kincaidi provenientes do Rio Miranda-Corumbá/MS, utilizando coloração convencional, impregnação por nitrato de prata, detecção de heterocromatina e coloração com fluorocromos base-específicos (CMA3 DAPI). Os exemplares de G. humeralis e C. kincaidi analisados apresentaram número diploide 2n=52 e fórmula cariotípica: 8m + 22sm + 22 st-a e 8m + 20sm + 24 st-a respectivamente. C. kincaidi apresentou um sistema de RON simples enquanto que os exemplares de G. humeralis apresentaram um sistema de RON múltiplos. O bandeamento C revelou marcações pericentroméricas em cromossomos sm e st-a em G. humeralis e em regiões pericentroméricas, terminais e intersticiais de cromossomos sm e st-a em C. kincaidi. Em G. humeralis os fluorocromos revelaram marcações CMA3+ nas regiões terminais de alguns cromossomos, enquanto que as marcações DAPI+ apresentaram localização coincidente com a dos blocos heterocromáticos. Em C. kincaidi, foram observados três pares com marcações CMA3+, sendo dois pares localizados na região terminal do braço longo e um par na região terminal do baço curto. Marcações DAPI+ foram localizadas nas regiões terminais do braço longo de poucos cromossomos, sendo possível constatar que em C. kincaidi apresenta heterocromatina rica em bases GC e outras em AT. Os resultados obtidos mostram que G. humeralis e C. kincaidi compartilham padrões citogenéticos semelhantes ao observados com outras espécies da subfamília Characinae, confirmando sua classificação baseada em traços morfológicos.