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O presente estudo teve como objetivo a produção de biossurfactantes por Pseudomonas fluorescens ATCC 13525, utilizando-se como única fonte de Carbono um resíduo da indústria canavieira, o melaço. Diferentes concentrações de melaço e tempos de fermentação foram avaliados. A produção de biossurfactantes foi monitorada por meio da tensão superficial, concentração de ramnose e índice de emulsificação (IE 24h). Os resultados mostraram a produção máxima de biossurfactantes ocorreu em 30h de fermentação, obtendo-se redução da tensão superficial do meio para 46,54 ± 1,1 mN/m e concentração de ramnose (243,95 ± 38,3 mg/L) com substrato a 3% de melaço. A análise positiva de ramnose sugere que o biossurfcatante produzido pode ser do tipo Ramnolipídeo, um glicolipídeo comumente produzido pelo gênero Pseudomonas. Os índices de emulsificação em óleo de soja mostraram que, mesmo em baixas concentrações de biossurfcatante, uma boa atividade emulsificante pôde ser notada (IE 24h de até 56%).