A pyranose oxidase was isolated from mycelium extracts of the basidiomycete Peniophora gigantea. This enzyme was purified 104-fold to apparent homogeneity with a yield of about 75% by steps involving fractionated ammonium sulphate precipitation, chromatography on DEAE-Sephacel, Sephacryl S 300, S Sepharose and Q Sepharose. The native pyranose oxidase has a relative molecular mass (MJ of 322800 It 18300 as determined on the basis of its Stokes' radius (rs = 6.2 nm) and sedimentation coefficient = 10.6), dynamic light-scattering experiments, gradient-gel electrophoresis and cross-linking studies. SDSPAGE resulted in one single polypeptide band of Mr76000 indicating that the enzyme consists of four subunits of identical size. The pyranose oxidase was shown to be an extremely stable glycoprotein with an isoelectric point of pH 5.3. It contains covalently bound FAD with an estimated stoichiometry of 3.6 molecules FAD/molecule enzyme. Pyranose oxidase was active with the substrates D-glucose, D-xylose, L-sorbose, D-galactose, methyl P-D-glucoside, maltose and D-fucose. Regioselective oxidation of D-glucose, L-sorbose and D-xylose to 2-keto-~-glucose, 5-keto-~-fructose and 2-keto-D-xylose, was demonstrated by identifying the reaction products by mass spectroscopy I3C-NMR spectroscopy and 'H-NMR spectroscopy after purification and derivatization. The pH optimum of the pyranose oxidase was in the range pH 6.0-6.5 in 0.1 M potassium phosphate, and its activation energy ( A H") for the conversion of D-glucose was 34.6 kJ/mol. The reactions with the sugars exhibited Michaelis-Menten kinetics, and the K, values determined for D-glucose, L-sorbose, D-xylose and oxygen were 1.1 mM, 50.0 mM, 29.4 mM and 0.65 mM, respectively. The activity of pyranose oxidase was only slightly affected by chelating reagents, thiol reagents, reducing reagents and bivalent cations each at 1 mM.

No abstract

Einleitung. -Bakterien der Gattung Streptomyces sind durch einen komplexen Entwicklungszyklus gekennzeichnet, bei dem sich auf festem Nahrboden aus einem Substratmycel ein Luftmycel bildet. In einem Sporulationsprozess konnen dann endstandige Luftmycel-Hyphen in Sporenketten fragmentieren. Experimentelle Befunde lassen vermuten, dass die Zelldifferenzierung in Luftmycel und Sporen wahrend des sekundaren Stoffwechsels stattfindet, also gleichzeitig mit der Synthese von Antibiotika, Pigmenten, Speicherstoffen und Geosminen.Uber die Regulation des Sekundarstoffwechsels und der Differenzierung bei Streptomyceten ist bisher wenig bekannt. Beide Prozesse scheinen aber, eng verbunden, durch zwei Gruppen von Signal-Substanzen kontrolliert zu werden, die entweder in der Zelle oder zwischen den Zellen vermitteln. ') 252. Mitteilung: [l]. ' ) 427Ochi [2] konnte kurzlich bei Streptomyceten zeigen, dass sowohl die Luftmycel-Entwicklung als auch die Antibiotika-Synthese stringent kontrolliert werden. Die stringente Kontrolle wird durch zwei intrazellulare Effektoren ausgelost, Guanosin-tetra-und Guanosin-pentaphosphat.Neben diesen bei Bakterien allgemein verbreiteten Effektoren sind interzellulare, stammspezifische Signal-Molekiile gefunden worden. Sie induzieren bei Actinomyceten Luftmycel-und/oder Antibiotika-Bildung wie z. B. der A-Faktor ((3R)-2-Isooctanoyl-3-(hydroxymethy1)-y-butyrolacton) [3] [4] und verwandte y-Lactone [5] [6], der B-Faktor (3'-( 1-Butylphosphory1)adenosin) [7], der C-Faktor, ein Protein rnit der Molmasse 34 500 Dalton [8], oder das jungst beschriebene Pamamycin-607, ein makrocyclisches Bislacton [9].Auf der Suche nach neuen interzellularen Signal-Substanzen haben wir rnit Hilfe des Agar-Diffusionstests unter 800 Streptomyceten einen Stamm gefunden, der eine Substanz mit der gewunschten Aktivitat produziert. Die Verbindung regt in geringer Konzentration die Luftmycel-und Antibiotika-Bildung beim Produzentenstamm und bei mehreren anderen Streptomycetenstammen an. Sie wurde deshalb Hormaomycin genannt (gr. hormbo = ich rege an).Produktion und Isolierung. -Der Produzent (Stamm W-384) des Hormaomycins wurde aus einer bei Anuradhapura (Sri Lanka) gesammelten Erdprobe isoliert. Er gehort zur Gattung Streptomyces, stimmt in allen artbestimmenden Merkmalen rnit dem Typusstamm von Streptomyces griseofavus iiberein und ist daher dieser Art zuzuordnen.Der Stamm W-384 wurde in einem 10-1-Fermenter submers in einer komplexen Nahrlosung angezogen. Entscheidend fur eine gute Produktausbeute war eine Temperaturanderung von 27 auf 20" nach 8 h Inkubation. Die Antibiotika-Bildung wurde rnit dem Agar-Diffusionstest und durch HPLC verfolgt und erreichte nach 45 h ein Maximum von 40 mg/l. Hormaomycin befand sich zu 98 % in den Zellen und konnte daraus rnit MeOH extrahiert werden. Die Reinigung zu einem einheitlichen Praparat gelang in mehreren Stufen: Extrahieren des Rohproduktes rnit AcOEt und aufeinanderfolgende Chromatographie an Kieselgel und Sephadex LH-20 in verschiedenen Losungsmitteln.Charakterisierung. -Hormaomycin...

Anteile Benzoesiiuremethylester konnten chromatographisch [20] P. Zanello, A. Cinquantini, Transifion M e f . Chem. 10 (1985) 370. [21] Die Diamine la-c wurden durch reduktive Aminierung der entsprechenden Ketone mit Ethylendiamin/Na[BH,(CN)] in Methanol erhaltcn. ebenfalls isoliert werden.

From the cultures of Streptomyces diastatochromogenes nium acetate. The structures were established by a detailed (strain Tu 2895) two novel benzo[b]fluorene quinones, na-spectroscopic analysis. The polyketide origin of 1 and 2 was med momofulvenone A (1) and B (2), were isolated. Difficul-verified by feeding [1,acetate to the growing cultures ties in their spectroscopic characterization due to salt effects of TU 2895. The momofulvenones represent the nitrogen-free were overcome by fermentation in the presence of ammo-parent compound of the kinamycin family of antibiotics.