The identification of protein ligands from a DNA-encoded library is commonly conducted by an affinity selection assay. These assays are often not validated for robustness, raising questions about selections that fail to identify ligands and the utility of enrichment values for ranking ligand potencies. Here, we report a method for optimizing and utilizing affinity selection assays to identify potent and selective peptidic ligands to the highly related chromodomains of CBX proteins. To optimize affinity selection parameters, statistical analyses (Z′ factors) were used to define the ability of selection assay conditions to identify and differentiate ligands of varying affinity. A DNA-encoded positional scanning library of peptidomimetics was constructed around a trimethyllysine-containing parent peptide, and parallel selections against the chromodomains from CBX8 and CBX7 were conducted over three protein concentrations. Relative potencies of off-DNA hit molecules were determined through a fluorescence polarization assay and were consistent with enrichments observed by DNA sequencing of the affinity selection assays. In addition, novel peptide-based ligands were discovered with increased potency and selectivity to the chromodomain of CBX8. The results indicate low DNA tag bias and show that affinity-based in vitro selection assays are sufficiently robust for both ligand discovery and determination of quantitative structure–activity relationships.

The five human polycomb (Pc) paralog proteins, chromobox homolog (Cbx) 2/4/6/7/8, are a family of chromodomain containing methyllysine reader proteins that are canonical readers of trimethyllysine 27 on histone 3 (H3K27me3). The aberrant expression of the Cbx7 gene is implicated in several cancers including prostate, gastric, thyroid, pancreas, and colon cancer. Previous reports on antagonizing the molecular recognition of Cbx7–H3K27me3 with chemical inhibitors showed an impact on prostate cancer cell lines. We report here on the design, synthesis, and structure–activity relationships of a series of potent peptidomimetic antagonists that were optimized on a trimethyllysine-containing scaffold to target Cbx7. The ligands were characterized using fluorescence polarization (FP) for their binding efficiency and selectivity against the Pc paralog Cbx proteins. The most selective ligand 9, as indicated by the FP data analysis, was further characterized using the isothermal titration calorimetry (ITC). Compound 9 exhibits a 220 nM potency for Cbx7 and exhibits 3.3, 1.8, 7.3 times selective for Cbx7 over Cbx2/4/8 and 28-fold selective over the HP1 family member Cbx1. Our research provides several potent and partially selective inhibitors for Cbx2/4/7 that do not contain trimethyllysine. Our models and binding data suggest that the aromatic cages of Cbx7/Cbx4 can accommodate larger alkyl groups such as diisobutyl substitution on the lysine nitrogen.

Die gefährlichste Variante des Malaria-Erregers, Plasmodium falciparum, infiziert jährlich 300-660 Millionen Menschen. [1] Die Plasmepsine (PM) bilden eine Familie von Aspartylproteasen, die von Plasmodium zum Abbau von menschlichem Hämoglobin und somit zur Lieferung der für das Wachstum benötigten Aminosäuren eingesetzt werden. [2,3] Ein auf der Plasmepsin-Hemmung beruhender Ansatz zu einer mögli-chen neuen Malariatherapie erfordert die Entwicklung breit wirksamer Liganden, welche die proteolytische Aktivität aller vier am Hämoglobin-Abbau beteiligten und in ihrer Aktivität überlappenden [4,5] Plasmepsine (PM I, PM II, PM IV und HAP) [6] blockieren, zugleich aber gegenüber den am nächsten verwandten humanen Aspartylproteasen (Cathepsin D und E (hCatD, hCatE)) inaktiv sind. Nur die Struktur von PM II ist im Detail aufgeklärt. [2,[7][8][9] Aufgrund der hohen Sequenzidentität zwischen den verschiedenen Plasmepsinen nahmen wir an, dass die Renin-ähnliche Konformation mit einer durch Öffnen einer Peptidschleife gebildeten Tasche (Abbildung 1 a), die in zwei [9,10] der vierzehn bekannten Kristallstrukturen von PM II beobachtet wird, auch für die drei anderen Enzyme zugänglich ist. Unter dieser Voraussetzung entwickelten wir Liganden, um die Wirksamkeit und Selektivität von Plasmepsinhemmern zu erforschen, welche die Schleifentasche besetzen.Unsere ersten Hemmer (Abbildung 1 b) waren gegen PM II nur mäßig aktiv (IC 50 = 3000-35 000 nm; IC 50 = Inhibitorkonzentration, bei der 50 % der maximalen Anfangsgeschwindigkeit gemessen wird). [11][12][13] Wir berichten hier über Aufbau und Funktionalisierung eines neuen bicyclischen Diamingerüsts, das wie eine Klammer Wasserstoffbrücken zu den beiden katalytischen Aspartatresten bildet (Abbildung 1 c). Dabei bietet die exo-Aminogruppe zusätzlich einen Abbildung 1. Plasmepsin II und die diskutierten Inhibitoren: a) das aktive Zentrum mit der katalytischen Diade, der S1/S3-Tasche und der Schleifentasche; b) ein bicyclisches Amin wechselwirkt mit der katalytischen Aspartat-Diade von Plasmepsin II; c) eine "Diaminklammer" kann eine zusätzliche Wasserstoffbrücke zu den katalytischen Aspartatresten ausbilden.

No abstract

Vier negative Ladungen bewachen den Eingang zu der tiefen, mit aromatischen Systemen ausgekleideten Tasche eines synthetischen Rezeptors (siehe Bild), der Acetylcholin und Cholin in wässriger Lösung mit hoher Affinität bindet. In Größen‐, Form‐ und Ladungserkennung entspricht das synthetische Modell dem natürlich vorkommenden Enzym.